馬春燕， 常婷婷， 魯雅妮， 何亞莉， 劉曙民

（1.寶雞市中心醫(yī)院藥劑科，陜西寶雞721000；2.寶雞市人民醫(yī)院介入科，陜西寶雞721000）

免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）腎病是一種臨床病理綜合征，具有多種臨床表現(xiàn)，以肉眼或鏡下血尿、腎小球系膜中IgA沉積為特征[1]。IgA腎病是全世界最常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎，其發(fā)病率受地區(qū)和種族的影響，IgA腎病發(fā)病率最高的地區(qū)是亞洲，占腎小球疾病的60%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐洲和美國(guó)[2]。盡管已有多種治療方案用于IgA腎病的治療，但該病通常會(huì)逐漸演變?yōu)榻K末期腎病[3]，因此，迫切需要一種可行且有效的治療方法。粉防己為防己科植物粉防己（石蟾蜍）Stephania tetrandraS.Moore的根，性寒，味苦，具有利水消腫、祛風(fēng)止痛的功效，常用于治療水腫腳氣、小便不利、風(fēng)濕痹痛、濕疹瘡毒、高血壓等病癥。漢防己甲素又稱為粉防己堿，是從粉防己中提取的雙芐基異喹啉生物堿，在我國(guó)幾十年來(lái)一直用于治療風(fēng)濕痛和關(guān)節(jié)痛[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、治療白血病、逆轉(zhuǎn)多重耐藥性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生理活性[5]。已有研究表明，漢防己甲素在防止腎小球硬化、保護(hù)腎小管功能、預(yù)防和逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化、保護(hù)腎臟功能等方面發(fā)揮一定的作用，對(duì)腎病大鼠具有良好的治療效果[6]。因此，本研究旨在探討漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠腎功能紊亂和腎組織損傷的影響，以期為其臨床治療IgA腎病提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。

1.2藥物、試劑與儀器漢防己甲素（批號(hào)：T2695），為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，化學(xué)式：C38H42N2O6，分子量：622.75，純度為100%。蘇木素-伊紅（HE）染液（貨號(hào)：D006-1-1）、尿蛋白定量測(cè)試盒（貨號(hào)：C035-2-1）、肌酐測(cè)試盒（貨號(hào)：C011-2-1）、尿素氮測(cè)試盒（貨號(hào)：C013-2-1）、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A001-3-2）、丙 二 醛（MDA）測(cè)試盒（貨 號(hào)：A003-1-2）、乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒（貨號(hào)：A020-2-2）、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡原位檢試盒（貨號(hào)：G002-1-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。邁瑞B(yǎng)S-280全自動(dòng)生化分析儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；DM750熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher公司）；U-T6A可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海屹譜儀器制造有限公司）。

1.3 分組與動(dòng)物模型的建立將60只大鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、漢防己甲素5 mg·kg-1組、漢防己甲素15 mg·kg-1組和漢防己甲素30 mg·kg-1組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠參照梁素忍等[7]方法采用脂多糖+牛血清蛋白+四氯化碳法建立IgA腎病模型。方法：隔日給予灌胃牛血清白蛋白400 mg·kg-1，持續(xù)6周，同時(shí)每周1次皮下注射0.1 mL四氯化碳和0.5 mL蓖麻油的混合溶液，持續(xù)9周，并分別在在第6周和第8周尾靜脈注射脂多糖0.05 mg·kg-1，10周后以肉眼或鏡下可見(jiàn)血尿且血尿中尿紅細(xì)胞30%以上發(fā)生變形作為造模成功的參照標(biāo)準(zhǔn)。造模完成后，漢防己甲素5 mg·kg-1組、漢防己甲素15 mg·kg-1組和漢防己甲素30 mg·kg-1組分別腹腔注射相應(yīng)劑量的漢防己甲素[8]，正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)28 d。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 腎功能指標(biāo)收集大鼠尿液、血液，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)尿液中蛋白的含量，血清肌酐、尿素氮水平。

1.4.2 HE染色取大鼠腎組織，先用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定48 h，然后以石蠟包埋制作成切片（厚度5 μm），進(jìn)行HE染色。在400倍熒光顯微鏡下觀察腎組織損傷情況。

1.4.3 TUNEL染色取大鼠腎組織切片，用二甲苯浸洗2次脫蠟，每次5 min，梯度乙醇脫水。按照TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）采用ELISA法檢測(cè)腎組織、血清IL-6、IL-10水平。具體操作方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定。

1.4.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)采用水溶性四唑鹽1（WST-1）法測(cè)定血清總SOD活力，微板法測(cè)定血清LDH活力，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定SOD、LDH吸光度值。硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定血清丙二醛（MDA）含量，用可見(jiàn)分光光度計(jì)于532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定MDA吸光度值。具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法取大鼠腎組織，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取蛋白質(zhì)樣品（20 mg），在100℃條件下變性5 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，加入一抗Caspase-3于4℃孵育過(guò)夜，清洗，然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗4℃孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。應(yīng)用ImageJ軟件分析灰度值。Caspase-9、SIRT1、P65、p-P65檢測(cè)方法同上。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用獨(dú)立的t檢驗(yàn)，多組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠24 h尿蛋白，血清肌酐、尿素氮水平的影響圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組24 h尿蛋白，血清肌酐、尿素氮水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢防己甲素15、30 mg·kg-1組24 h尿蛋白，血清肌酐、尿素氮水平顯著降低（P＜0.05）。

圖1 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠24 h尿蛋白，血清肌酐、尿素氮水平的影響Figure 1 Effects of tetrandrine on the 24-hour urineprotein，serum creatinine and urea nitrogen levels in rats with immunoglobulin A nephropathy

2.2 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠病理?yè)p傷程度的影響圖2結(jié)果顯示：正常組大鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠腎小球系膜細(xì)胞增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性且排列不規(guī)則，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；漢防己甲素15、30 mg·kg-1組腎組織病理?yè)p傷程度較模型組明顯改善。

圖2 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠病理?yè)p傷程度的影響（HE染色，×200）Figure 2 Effects of tetrandrine on the degree of pathological damage in renal tissue in rats with immunoglobulin A nephropathy（by HE staining，×200）

2.3 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值的影響圖3-A結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組腎組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多；與模型組比較，漢防己甲素15、30 mg·kg-1組腎組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。

圖3 -B結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組腎組織cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，漢防己甲素15、30 mg·kg-1組cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值顯著降低（P＜0.05）。

圖3 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響Figure 3 Effects of tetrandrine on the TUNEL positive cells and expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 proteins in rats with immunoglobulin A nephropathy

2.4 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠腎組織和血清中IL-6、IL-10水平的影響圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組腎組織和血清中IL-6水平顯著升高（P＜0.05），IL-10水平亦升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與模型組比較，漢防己甲素15、30 mg·kg-1組腎組織和血清中IL-6水平顯著降低（P＜0.05），IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。

圖4 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠腎組織和血清中IL-6、IL-10水平的影響Figure 4 Effects of tetrandrine on the levels of IL-6 and IL-10 in kidney tissue and serum in rats with immunoglobulin A nephropathy

2.5 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠SOD、MDA、LDH水平的影響圖5結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組SOD水平顯著降低（P＜0.05），MDA、LDH水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢防己甲素15、30 mg·kg-1組SOD水平顯著升高（P＜0.05），MDA、LDH水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠SOD、MDA、LDH水平的影響Figure 5 Effects of tetrandrine on SOD，MDA and LDH levels in rats with immunoglobulin A nephropathy

2.6 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠SIRT1蛋白水平、p-P65/P65比值的影響圖6結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組SIRT1蛋白水平顯著降低（P＜0.05），p-P65/P65比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢防己甲素15、30 mg·kg-1組SIRT1蛋白水平顯著升高（P＜0.05），p-P65/P65比值顯著降低（P＜0.05）。

圖6 漢防己甲素對(duì)IgA腎病大鼠SIRT1、P65、p-P65蛋白表達(dá)水平的影響Figure 6 Effects of tetrandrine on the expression levels of SIRT1，P65 and p-P65 proteins in rats with immunoglobulin A nephropathy

3 討論

血清肌酐和尿素氮是評(píng)估腎功能恢復(fù)情況的關(guān)鍵指標(biāo)，腎損傷時(shí)血清肌酐和尿素氮的濃度會(huì)增加，故通過(guò)這2個(gè)指標(biāo)的變化可間接反映腎功能損傷的程度。24 h尿蛋白定量是診斷IgA腎病進(jìn)展性的強(qiáng)有力指標(biāo)，雖然部分少量尿蛋白的IgA腎病患者病情仍較嚴(yán)重，但控制尿蛋白對(duì)于限制腎損傷程度具有重要作用[9]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)漢防己甲素干預(yù)，IgA腎病大鼠腎組織病理?yè)p傷程度減輕，24 h蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平降低。提示漢防己甲素可改善IgA腎病大鼠腎損傷。

細(xì)胞凋亡是由多種基因調(diào)控的自主程序性死亡，是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的重要機(jī)制，Caspase-9、Caspase-3在凋亡級(jí)聯(lián)中過(guò)度活化能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。有研究[11]表明，IgA腎病腎小球凋亡細(xì)胞數(shù)量較其他型腎炎增多，提示細(xì)胞凋亡參與了IgA腎病腎小球損傷。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，其在IgA腎病患者腎組織中表達(dá)上調(diào)，且與24 h尿蛋白，血清肌酐、尿素氮水平呈正相關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)漢防己甲素干預(yù)，IgA腎病大鼠腎組織增多的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞減少，升高的cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值降低。提示漢防己甲素可抑制IgA腎病大鼠腎組織細(xì)胞凋亡。

炎癥反應(yīng)在IgA腎病發(fā)病中起著重要的作用。IL-6是促炎因子，由腎臟上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞等分泌，可誘導(dǎo)并加劇腎纖維化病變，可通過(guò)提高系膜細(xì)胞蛋白酶活性及內(nèi)皮細(xì)胞的促凝血活性等途徑加重腎損傷，故其水平高低可反映腎組織炎性損傷程度[13]。IL-10一般表現(xiàn)為炎癥抑制作用，在TNF-α存在時(shí)表現(xiàn)為促炎作用，故在不同疾病中的作用存在差異。研究[14]發(fā)現(xiàn)，IL-10血清水平升高可單獨(dú)或協(xié)同IL-4呈劑量依賴性地抑制IgA腎病患兒炎癥細(xì)胞因子的釋放。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)漢防己甲素干預(yù)，IgA腎病大鼠腎組織和血清中增高的IL-6水平降低，IL-10水平升高。提示漢防己甲素可通過(guò)抑制炎癥因子的釋放改善IgA腎病腎損傷。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體氧化/抗氧化功能平衡失調(diào)導(dǎo)致組織細(xì)胞氧化損傷的過(guò)程。相關(guān)研究顯示，成人IgA腎病患者的血漿及腎臟局部存在氧化應(yīng)激水平升高，表明氧化應(yīng)激參與IgA腎病的發(fā)生發(fā)展[15]。SOD作為抗氧化物酶，可清除細(xì)胞中ROS，具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用，是常見(jiàn)的檢測(cè)氧化應(yīng)激水平的指標(biāo)[16]。氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA、LDH水平過(guò)高會(huì)導(dǎo)致腎功能減退[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)漢防己甲素干預(yù)，IgA腎病大鼠血清減低的SOD水平升高，增高的MDA、LDH水平降低。提示漢防己甲素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)IgA腎病大鼠起保護(hù)作用。

SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的去乙?；福?dāng)SIRT1發(fā)生去乙酰化反應(yīng)后會(huì)作用于下游核因子（NF）-κB信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[17]。NF-κB是廣泛存在的同源或異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞存活、分化與增殖，參與機(jī)體防御、組織損傷、應(yīng)激及炎癥過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控[18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)漢防己甲素干預(yù)，IgA腎病大鼠腎組織低表達(dá)的SIRT1蛋白水平升高，高表達(dá)的p-P65/P65比值降低。提示漢防己甲素可通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB通路對(duì)IgA腎病大鼠起保護(hù)作用。

綜上所述，漢防己甲素可抑制IgA腎病大鼠細(xì)胞凋亡、炎癥因子的釋放、氧化應(yīng)激，對(duì)IgA腎病大鼠腎功能紊亂和腎組織損傷起修復(fù)作用，推測(cè)其作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。