商麗紅，楊玉娥，王 芳，王文霞，哈春芳

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是育齡期婦女常見的激素依賴性疾病，引起子宮內(nèi)膜異位癥的原因目前尚不清楚，月經(jīng)血回流被認為是最有可能引起子宮內(nèi)膜異位癥的原因，其他原因包括遺傳因素、免疫紊亂、雌激素失衡和手術(shù)等[1]。蛋白激酶Cβ1(Protein Kinase Cβ1，PKCβ1)是蛋白激酶家族中的一員，腫瘤學(xué)研究顯示，PKCβ1參與了多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，并在細胞的增殖、侵襲、黏附等方面發(fā)揮重要作用[2]。絲裂原激活的蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)是MAPK信號通路的關(guān)鍵組成部分，該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將細胞外信號傳遞到細胞核中，級聯(lián)激活多種蛋白，包括Ras、Raf、MEK和ERK。作為MAPK/ERK信號中至關(guān)重要的蛋白，MEK1/2被其上游RAF激酶磷酸化并激活。因此，MEK1/2的激活導(dǎo)致MAPK信號通路與多樣化的細胞過程有關(guān)，包括細胞增殖、分化、細胞存活和細胞凋亡[3]。本研究通過檢測PKCβ1、MEK1/2在子宮內(nèi)膜組織和原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達情況，分析兩者與增殖侵襲相關(guān)蛋白的關(guān)系，進一步驗證其在子宮內(nèi)膜異位癥中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本獲?。菏占?019年5月-2020年9月因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥行腹腔鏡手術(shù)，于術(shù)后或術(shù)后經(jīng)病理科證實為Ems的患者60例，EMs在位內(nèi)膜組與EMs異位內(nèi)膜組各30例，同期因良性卵巢腫瘤行手術(shù)治療的患者30例作為對照組(正常子宮內(nèi)膜組)。本研究已經(jīng)通過醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署治療知情同意書。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)：研究對象年齡25～35歲，手術(shù)前患者月經(jīng)周期正常，近3個月均未接受過激素類藥物治療，無生殖道炎癥及其他婦科疾病等。

1.2 主要試劑：PKCβ1抗體、MEK1/2抗體、MMP9抗體、PCNA抗體、DAB顯色試劑盒、蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化法:組織標(biāo)本由病理科證實為EMs后于10%甲醛溶液中浸泡過夜，4%甲醛固定，脫水、石蠟包埋，3～4 μm厚度連續(xù)切片，在70 ℃烤箱過夜;經(jīng)過脫蠟，抗原修復(fù)，一抗孵育(PKCβ1、MEK1/2，4 ℃過夜)，二抗孵育2 h，DAB顯色，酒精梯度脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片，以PBS作為陰性對照，應(yīng)用Image pro plus進行數(shù)據(jù)處理。

1.3.2 原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞培養(yǎng)：組織于手術(shù)時用刮勺刮取內(nèi)膜，置于15 mL離心管中(含有配置好的培養(yǎng)基)，再置于冰盒中迅速送往實驗室。用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗子宮內(nèi)膜組織中的血液成分，用眼科剪將內(nèi)膜剪成約1 mm3大小的組織塊，加入膠原酶Ⅳ在37 ℃溫箱中吹打消化2次，每次10 min，吸取上清液加入離心管，1∶1的比例加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心，取上清加入60 mm培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察后置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 Western-blot檢測各組蛋白表達情況：按照凱基全蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細胞總蛋白，于酶標(biāo)儀中進行蛋白定量，并置于沸水中煮5～10 min至蛋白變性，室溫冷卻后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配?0%SDS分離膠及5%濃縮膠，插入相應(yīng)大小的梳子，加入蛋白樣品及蛋白marker進行電泳及轉(zhuǎn)膜，載有蛋白的PVDF膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉90min后，加入PKCβ1、MEK1/2，MMP9，PCNA，β-actin一抗4℃過夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，后加二抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，增強型ECL工作液顯影，于BIO-RAD成像中曝光成像，計算相應(yīng)的光密度比值。

2 結(jié)果

2.1 PKCβ1、MEK1/2在正常、EMs在位、EMs異位內(nèi)膜中的表達：PKCβ1、MEK1/2在間質(zhì)細胞和腺上皮細胞中均有表達，見圖1-圖6(封三)。EMs在位內(nèi)膜組、異位組中PKCβ1、MEK1/2的表達高于正常子宮內(nèi)膜組，且異位內(nèi)膜組的表達高于在位內(nèi)膜組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 PKCβ1、MEK1/2在3組子宮內(nèi)膜組織中的表達

2.2 PKCβ1、MEK1/2、MMP9、PCNA在子宮內(nèi)膜異位癥組及正常對照組間質(zhì)細胞中的表達：EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中PKCβ1，MEK1/2的表達高于正常對照組間質(zhì)細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中MMP9、PCNA的表達高于正常對照組間質(zhì)細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示EMs在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的侵襲和增殖性高于正常對照組間質(zhì)細胞，見圖7(封三)。

2.3 Pearson相關(guān)性分析：子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細胞中PKCβ1和MEK1/2的表達呈正相關(guān)(r=0.84，P<0.05)，PKCβ1和MMP9的表達呈正相關(guān)(r=0.77，P<0.05)，PKCβ1和PCNA的表達呈正相關(guān)(r=0.81，P<0.05)。MEK1/2和MMP9的表達呈正相關(guān)(r=0.82，P<0.05)，MEK1/2和PCNA的表達呈正相關(guān)(r=0.70，P<0.05)，提示PKCβ1和MEK1/2與間質(zhì)細胞的侵襲和增殖性相關(guān)。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女常見的雌激素依賴性疾病，其特征是子宮內(nèi)膜樣組織腺體或間質(zhì)出現(xiàn)在子宮腔以外的部位，常伴有瘢痕形成和粘連。但其病因和發(fā)病機制目前尚不清楚。

蛋白激酶C(Protein kinase C)由11個酯類依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族組成，它們影響多種細胞功能，包括增殖、分化和凋亡。PKC同工酶在多種癌癥中有表達變化，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]，PKCβ1參與了細胞分化增殖凋亡和血管生成等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)激活PKC信號通路可以促進子宮內(nèi)膜的生長發(fā)育[5]。Meola[6]等通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)PKCβ1在子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中表達增高。本研究中PKCβ1在子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜組織中的表達高于正常對照組，且異位內(nèi)膜中的表達高于在位內(nèi)膜，驗證了PKCβ1與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系。進一步分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，通過Western-blot檢測了間質(zhì)細胞中PKCβ1的表達，結(jié)果表明子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細胞中PKCβ1的表達水平明顯高于正常對照組間質(zhì)細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

MAPK信號通路通常由RAS、RAF、MEK、ERK組成，引發(fā)涉及MEK的級聯(lián)反應(yīng)，進而激活ERK，在調(diào)節(jié)真核細胞的基因表達中起重要作用，該信號通路控制著細胞生長、增殖、分化和遷移等細胞過程[7]。MAPK參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在卵巢癌[8]中MAPK被異常激活，誘導(dǎo)腫瘤細胞的異常增殖、侵襲和黏附。多項研究表明，MAPK在子宮內(nèi)膜異位癥中被激活，參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制，子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜細胞的增殖和存活與MAPK信號通路的異常激活有關(guān)[9]。在子宮內(nèi)膜異位癥中MAPK信號通路在細胞增殖、凋亡和遷移的調(diào)節(jié)中起著重要作用，可能通過增強子宮內(nèi)膜異位間質(zhì)細胞在體外纖維化微環(huán)境中的增殖和存活來支持子宮內(nèi)膜異位病變的生長[10]。因此MAPK信號通路的組成性激活參與多種癌癥的發(fā)生，而MEK1/2是MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分，在MAPK級聯(lián)反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[11]，主要功能是參與細胞生長、增殖和分化。在本研究中發(fā)現(xiàn)MEK1/2在子宮內(nèi)膜異位癥在位及異位內(nèi)膜組織中的表達高于正常對照組，且異位內(nèi)膜中的表達高于在位內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細胞中MEK1/2的表達水平明顯高于正常對照組間質(zhì)細胞。

基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)是介導(dǎo)細胞侵襲的關(guān)鍵酶，子宮內(nèi)膜組織和外周血中MMP9水平的改變是EMs發(fā)生的重要危險因素[12]。研究發(fā)現(xiàn)MMP9在EMs始終高表達[13]，與沒有子宮內(nèi)膜異位癥的婦女子宮內(nèi)膜相比，MMP9的含量更高，具有更強的侵襲性[14]。多項研究已經(jīng)檢測到與健康對照組相比，子宮內(nèi)膜異位癥婦女腹水、血液、血漿、腹腔液、血清和尿液中MMP9蛋白水平顯著升高[15]。增殖細胞核抗原(PCNA)是細胞核中的一種酸性蛋白，是合成所必需的輔酶，PCNA水平代表細胞的增殖活性。本研究也發(fā)現(xiàn)MMP9、PCNA在子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細胞中存在高表達，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MMP9、PCNA與PKCβ1，MEK1/2存在正相關(guān)關(guān)系，但其具體的調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。