劉 琳，鄒俊波，張小飛，王 媚，郭東艷，周 曉，王 林，張 雪，史亞軍

（陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046）

近些年，人們的生活和工作以及學(xué)習(xí)壓力不斷增加，使得抑郁癥和焦慮癥患病率也大幅度提升。據(jù)統(tǒng)計，全世界患有抑郁癥的人數(shù)占3.01%～5.00%，患有焦慮癥占4.00%～6.50%［1］。在我國18歲以上的成年人當(dāng)中，23.4% 的人有抑郁癥狀，4.6%的人患有抑郁癥［2］，4.98%的人患有焦慮，其中大學(xué)生和就業(yè)人群甚為嚴(yán)重。目前，治療抑郁和焦慮的藥物主要是以西藥為主，如艾司西酞普蘭、文拉法辛、苯二氮卓類等藥物。但其副作用大、依賴性強、用藥周期長，給患者身體帶來了一定的傷害。

逍遙丸收錄于宋代的《太平惠民和劑局方》，由柴胡、薄荷、當(dāng)歸、芍藥、茯苓、白術(shù)以及生姜、甘草組成。具有疏健脾、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、肝氣不舒等功效，臨床上應(yīng)用于婦女乳腺增生、經(jīng)前期綜合征、月經(jīng)失調(diào)、多囊卵巢綜合征、圍絕經(jīng)期綜合征、慢性肝炎腸易激綜合征、神經(jīng)功能紊亂綜合征以及焦慮和抑郁癥等多種疾?。?，4］。尤其在婦科疾病的應(yīng)用極為廣泛，被稱為“女科圣藥”。同時它作為疏肝法的代表方，近些年來在治療焦慮癥和抑郁癥中效果也頗為顯著。但中藥復(fù)方具有“多成分、多靶點”的特點，使得逍遙丸治療抑郁癥和焦慮癥的作用機制尚未得到很好的闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，分析藥物與該網(wǎng)絡(luò)中特定節(jié)點或模塊之間的相互作用，從而了解藥物與機體相互作用的科學(xué)?；凇岸嗷?多靶點-復(fù)合疾病”模型，系統(tǒng)地探討了藥物與疾病之間的關(guān)系［5，6］。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中藥復(fù)方相結(jié)合，可以解釋中藥的作用機理，找到中藥的有效物質(zhì)。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究逍遙丸治療抑郁和焦慮的機制，為抑郁癥和焦慮癥的防治提供新思路，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材成分靶點

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）對逍遙丸中八味藥材：柴胡、薄荷、當(dāng)歸、芍藥、茯苓、白術(shù)、生姜、甘草分別進行化學(xué)成分搜集。根據(jù)ADME 參數(shù)設(shè)置口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18 為篩選條件，獲得具有較高活性的化合物成分以及靶點。

1.2 疾病靶點收集

分 別 以“anxiety”、“depressive disorder”為 關(guān) 鍵檢索詞在Malacards 和Genecards 兩個數(shù)據(jù)庫查找與其相關(guān)的基因靶點。Genecards 數(shù)據(jù)庫首頁輸入檢索詞后分別以Score≥9.00、Score≥25.00 為篩選條件找到相對應(yīng)的疾病靶點。

1.3 “藥材成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)上述預(yù)測與篩選結(jié)果，刪除沒有對應(yīng)靶點的成分以及重復(fù)的靶點。利用Venny 2.1.0 找到與疾病的共同靶點。創(chuàng)建“藥材成分-靶點”、“疾病-靶點”關(guān)系文件以及屬性文件，導(dǎo)入到Cytoscap（3.2.1）構(gòu)建“藥材成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白-蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將疾病與藥材的共同靶點輸入String 中的“multiple proteins”，選擇“Homo sapiens”檢索。下載蛋白相互作用的tsv 文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 根據(jù)節(jié)點自由度選擇篩選重要靶點。

1.5 生物通路富集分析

在R 軟件平臺安裝cluster profiler 軟件包，對重要靶點進行GO 和kegg 功能富集分析，將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式輸出。再使用R 平臺的top GO軟件包構(gòu)建交互網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 成分靶點收集結(jié)果

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共收集了161 種化合物，其中柴胡17 種、當(dāng)歸2 種、白芍13 種、茯苓15 種、白術(shù)7 種、生姜5 種、甘草82 種、薄荷20 種。八味藥材總共含有247 個靶點（不包括重復(fù)靶點）。

2.2 疾病靶點的篩選結(jié)果

Malacards 數(shù)據(jù)庫中找到關(guān)于焦慮癥的靶點8個、抑郁癥靶點4 個。Genecards 數(shù)據(jù)庫中以Score≥9.00 找到關(guān)于焦慮癥的靶點有337 個，Score≥25.00 的找到關(guān)于抑郁癥的靶點有379 個。將兩個數(shù)據(jù)庫找到的靶點去除重復(fù)靶點后焦慮癥的相關(guān)靶點有337 個，抑郁癥的相關(guān)靶點有379 個。分別將藥材成分靶點和疾病靶點輸入Venny 2.1.0 作圖后，發(fā)現(xiàn)疾病與藥材共同靶點有24 個，焦慮癥和抑郁癥的共同靶點有150 個，見圖1。

圖1 逍遙丸與疾病之間共同靶點圖Fig 1 Common targets between Xiaoyao Wan and diseases

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將24 個共同靶點上傳至String 數(shù)據(jù)庫，組織（organism）設(shè)置為“Homo sapiens”得到蛋白與蛋白之間相互作用的圖，如圖2。然后下載PPI tsv 文件將其導(dǎo)入Cytoscape，再將疾病-靶點、藥材-靶點導(dǎo)入Cytoscape 中作出“逍遙丸-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3 所示。利用Network Analyer 計算出網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點“betweenness centrality”、“closeness centrality”、“degree”后，在NetworkAnalye 中 的Visualize Parameters 選擇“Degree”得到圖4。圖中顏色越深節(jié)點越大表示相關(guān)性越強、越重要。度值由高到低為鈉依賴性去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體（APP）、D（2）多巴胺受體（DRD2）、鈉依賴型5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（SLC6A 4）、白 細 胞 介 素-6（IL-6）、MU 型 阿 片 受 體（OPRM1）、過氧化氫酶（CAT）、胺氧化酶［含黃素］A（MAOA）、5-羥色胺受體2A（HTR2A）、單胺氧化酶B（MAOB）、白細胞介素-1β（IL-1β）、5-羥色胺受體3A（HTR3A）、大麻素受體1（CNR1）、鈉依賴型多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白（SLC6A3）、D（2）多巴胺受體（DRD1）、雌激素受體（ESR1）、白細胞介素-10（IL-10）、雌激素受體（ESR1）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、超氧化物歧化酶［Cu-Zn］（SOD1）、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運蛋白基因（SLC6A2）、γ-氨基丁酸受體亞單位α-2（GABRA2）、血清對氧磷酶/芳香酯酶1（PON1）、γ-氨基丁酸受體亞單位α-1（GABRA1）、神經(jīng)元型乙酰膽堿受體亞單位α-7（CHRNA7）。

圖2 String 中24 個蛋白之間相互關(guān)系圖Fig 2 The relationship diagram of 24 proteins in String

圖3 “逍遙丸-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 The network diagram of“Xiaoyao Wan-targetsdiseases”

圖4 靶點與靶點相互關(guān)系圖Fig 4 The relationship map between targets

2.4 功能富集分析

為了解逍遙丸在治療抑郁和焦慮中發(fā)揮作用的機制，本文通過R 語言的cluster profiler 軟件包執(zhí)行GO 和KEGG，共富集并排列了1 231 條路徑，其中KEGG 有72 條路徑，表1 顯示了前10 條路徑。圖5 的氣泡圖是根據(jù)P值大小排列的，P值越小表示該路徑與疾病的相關(guān)性越強?？梢钥闯錾窠?jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、5-羥色胺能突觸（serotonergic synapse）、可卡因成癮（cocaine addiction）、多巴胺能突觸（dopaminergic synapse）、酒精中毒（alcoholism）、苯丙胺成癮（amphetamine addiction）、嗎啡成癮（morphine addiction）、朊病毒病（prion diseases）、非洲錐蟲病（African trypanosomiasis）、尼古丁成癮（Nicotine addiction）等參與抑郁和焦慮的病理發(fā)展。通過圖6 和表2 可以了解到這些路徑上的靶點如DRD2、DRD1、HTR2A、MAOB、MAOA、SLC6A3 是同時作用于許多不同的路徑。通過cluster profiler 包重建了圍棋交互網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)反映這些圍棋術(shù)語之間的內(nèi)部關(guān)系，根據(jù)圖7 可以看出圓點顏色越紅形狀越大代表此路徑與該病理發(fā)展越明顯。

圖5 KEGG 前20 條P 值顯著的通路富集氣泡圖Fig 5 Enrichment of the first 20 pathways of KEGG pathway

圖6 抑郁、焦慮、逍遙丸靶點的KEGG 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 6 KEGG interaction network diagram of depression，anxiety and Xiaoyao Wan targets

圖7 核心靶點調(diào)控途徑網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Network diagram of core targes regulation pathway

表1 KEGG 通路富集前10 條路徑Tab 1 Enrichment of the first 10 pathways of KEGG pathway

表2 數(shù)字所代表的靶點Tab 2 Targets represented by number

GO 分析結(jié)果表示，在“生物過程（BP）”中富集1 024 條路徑，根據(jù)矯正后的P值進行排序得到柱形圖，見圖8。由圖可以看出，逍遙丸治療抑郁和焦慮的靶點主要參與對有毒物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance）、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)（regulation of neurotransmitter levels）等過程的調(diào)節(jié)。GO 分析在“細胞成分（CC）”中富集了54 條路徑，P值最顯著的前20 項如圖9，從細胞組分的富集結(jié)果來說主要參與了突觸后膜（postsynaptic membrane）、突觸前（presynapse）、突觸前膜積分成分突觸前膜（presynapse）等部位。GO 分析結(jié)果在“分子功能（MF）”中富集了81 條路徑，圖10 列出了前20 條。從分子功能富集結(jié)果可以看出，逍遙丸治療抑郁和焦慮主要體現(xiàn)在神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）、銨離子結(jié)合（ammonium ion binding）、無機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白活性（inorganic cation transmembrane transporter activity）、陽離子轉(zhuǎn)運蛋白活性（cation transmembrane transporter activity）等方面。

圖8 “生物過程（BP）”前20 條P 值顯著的通路富集圖Fig 8 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "biological process（BP）"

圖9 “細胞成分（CC）”前20 條P 值顯著的通路富集圖Fig 9 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "cellular component（CC）"

圖10 “分子功能（MF）”前20 條P 值顯著的通路富集圖Fig 10 Enrichment diagrams of the first 20 pathways with significant P value in "molecular function（MF）"

3 討論

抑郁和焦慮被認為是常見的、不易治愈、發(fā)病率逐年增高的精神類疾病，致病因素較為復(fù)雜，其發(fā)病機制尚不明確。中醫(yī)研究認為，抑郁和焦慮是由于情志不舒、氣機郁滯、肝疏泄失常所引起的，隸屬于情志病、心病的范疇?，F(xiàn)代研究對抑郁癥和焦慮癥發(fā)病機制主要是從神經(jīng)遞質(zhì)假說，神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂假說以及免疫功能紊亂假說等方面進行解釋。

逍遙丸治療疾病達八十多種，涉及婦科、內(nèi)科、消化科、兒科以及皮膚科，在臨床上廣為應(yīng)用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)逍遙丸具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、保肝利膽、改善微循環(huán)、改善胃腸道功能性等作用。近幾年在神經(jīng)系統(tǒng)方面應(yīng)用居多，主要應(yīng)用于抑郁癥和焦慮癥。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)借助多種生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及Cytoscape 軟件等構(gòu)建了逍遙丸治療抑郁癥和焦慮癥的“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)以及蛋白-蛋白互作，并對關(guān)鍵節(jié)點以及通路進行了分析。通過以上的研究與分析，發(fā)現(xiàn)逍遙丸化合物成分主要集中在5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、對神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、APP、DRD2、SLC6A4、IL-6、CAT、HTR2A、IL-1β、HTR3A、SLC6A3、DRD1、IL-10、SLC6A2、GABRA2、GABRA1 等通路或靶點。

5-羥色胺能突觸與5-HT 密切相關(guān)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT 的含量及功能異常會導(dǎo)致抑郁、焦慮、精神分裂等精神類疾病。有研究發(fā)現(xiàn)，焦慮模型小鼠大腦中縫背核的5-HT 能神經(jīng)元的活性明顯增加，將5-HT1A 受體激動劑注射到海馬和杏仁核后發(fā)現(xiàn)會起到抗焦慮作用［7，8］。Hendricks 等［9］將與5-HT 能系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Pet-1 敲除后，小鼠中樞5-HT 能神經(jīng)元缺失、海馬等腦區(qū)5-HT 含量顯著減少，Pet-1-/-小鼠的焦慮水平顯著高于野生型小鼠。突觸后5-HT1AR 與5-HT 結(jié)合會激活5-HT 的分泌，加強細胞信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)從而改善抑郁癥狀［10］。在應(yīng)激反應(yīng)中，5-HT2A 受體表達升高會增進動物焦慮和抑郁樣行為，當(dāng)其下調(diào)后癥狀明顯減輕［11，12］。多巴胺能突觸參與腦內(nèi)多巴胺（DA）的合成，DA 在愉快感覺的產(chǎn)生、傳遞以及愉快信息的存儲過程中發(fā)揮著重要作用。相應(yīng)膜受體激活是DA發(fā)揮作用的關(guān)鍵，DA 受體具有5 種亞型可分成DRD1 和DRD2 兩類。吳帥等［13］研究證明多巴胺抗抑郁作用是通過DRD1 抑制谷氨酸及其NMDA 受體NR2B 亞基因表達來實現(xiàn)。DRD2 激活后也可導(dǎo)致抑郁的發(fā)生，當(dāng)DRD2 被激活后，細胞內(nèi)cAMP 水平降低，在產(chǎn)后抑郁初期，它的表達明顯升高不但抑制cAMP 的產(chǎn)生而且也影響DA 生成，進而導(dǎo)致抑郁癥加重［14］。神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路的受體含4 類可分為A 類（視紫紅質(zhì)樣）、B 類（分泌素樣）、C 類（親代謝性谷氨酸鹽/外激素）和離子通道/其他受體，當(dāng)出現(xiàn)焦慮時會導(dǎo)致A 類受體表達下調(diào)［15］。IL-6、IL-1B、IL-10 屬于炎癥細胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、參與機體的信號傳遞作用。申永輝等［16］發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者經(jīng)SSRI 類藥物治療后，血清中炎癥細胞因子水平明顯下降，抑郁癥狀得到改善。GABRA2、GABRA1 是γ-氨基丁酸的受體，而γ-氨基丁酸是哺乳動物腦內(nèi)廣泛分布的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與受體結(jié)合參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)元活性［17，18］。研究發(fā)現(xiàn)，GABRA2、GABRA1 參與了抑郁發(fā)病機制［19］。APP 是去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體（NET）的一種，NET 被認為是去甲腎上腺素再攝取抑制劑（NRI）抗抑郁作用的靶點。許多常用抗抑郁藥物作為NET 的高親和力底物可抑制NET 對突觸間隙NE 的重攝?。?0］。小鼠的去甲腎上腺素基因（SLC6A2）敲除后使得去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體缺乏，可能導(dǎo)致抗應(yīng)激行為［21，22］，有研究表明，SLC6A3、SLC6A2、DRD2 等基因的交互作用可能在中國漢族人群發(fā)生抑郁中起重要作用［23］。

通過在TCMSP 中的篩選發(fā)現(xiàn)逍遙丸中含有柴胡皂苷、芍藥苷、beta-谷甾醇、茯苓酸、槲皮素、白術(shù)內(nèi)酯以及豆甾醇等化學(xué)成分。柴胡皂苷A 可調(diào)節(jié)炎癥因子及相關(guān)通路，提高神經(jīng)營養(yǎng)因子含量，改善5-HT、DA 水平，下調(diào)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能發(fā)揮抗抑郁和焦慮的作用［24，25］。芍藥苷是一種雙向抗炎免疫調(diào)節(jié)藥，可降低慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證焦慮模型大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α，對改 善 焦 慮 和 抑 郁 有 一 定 作 用［26，27］。Beta-谷 甾 醇 是一種常見的植物甾醇，具有良好的抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理活性［28］。茯苓酸具有抗炎作用，通過減弱白細胞與微血管內(nèi)皮細胞間的黏附，抑制腸黏膜微血管內(nèi)皮細胞的過量分泌，阻止過多白細胞到達炎癥部位和過度炎癥反應(yīng)［29］。槲皮素屬于黃酮類化合物，具有神經(jīng)保護作用。白術(shù)內(nèi)酯通過抑制NLRP3 炎性體的激活來從而減少IL-1β的產(chǎn)生，在慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激（CUMS）誘導(dǎo)的小鼠抑郁模型中發(fā)揮抗抑郁樣作用［30］。豆甾醇能明顯減少氯胺酮引起的小鼠的自發(fā)活動、刻板行為、強化降壓延遲等一些精神病癥狀，增加γ-氨基丁酸（GABA）、減少多巴胺、并且能顯著降低結(jié)腸組織炎性因子［31］。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)逍遙丸可能通過柴胡皂苷、芍藥苷、白術(shù)內(nèi)酯、茯苓酸等化學(xué)成分作用于5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等相關(guān)通路。推測逍遙丸通過神經(jīng)遞質(zhì)影響5-HT、DA、參與下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）以及干預(yù)炎癥反應(yīng)過程起到治療抑郁和焦慮作用。此外，對于上述討論中剩余通路與靶點的相關(guān)研究報道較少，可為今后深入研究抗抑郁與焦慮作用潛在靶點的分子機制研究提供線索。