梁瑞敏，王 凱，陳 悅，曹金一，喬 逸，馮智軍，楊志福*

1陜西中醫(yī)藥大學藥學院，咸陽 712046；2空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科，西安 710032

近年來缺血性腦卒中的致殘率和死亡率持續(xù)上升[1]。缺血性腦卒中是最常見的中風類型，發(fā)生在頸部或腦部血管阻塞時，導致腦組織局部缺血缺氧，引起腦組織軟化甚至壞死的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。目前西醫(yī)治療缺血性腦卒中的方法有抗血小板治療、急性期降壓處理及去血腫顱骨切除術、腦室內置管引流術、微創(chuàng)穿刺血腫清除術等[3,4]。這些方法迅速、有效，但也伴隨一些副作用，如術后再出血、感染及神經(jīng)損傷、腦灌注壓不足等風險。目前中藥改善缺血性腦卒中的主要作用包括對抗缺血性腦卒中后的細胞凋亡，減少出血量，同時緩解腦血管痙攣、腦水腫以及神經(jīng)功能障礙等并發(fā)癥，進而降低炎性反應。

紅花為菊科紅花CarthamustinctoriusL.的干燥花，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之效[5]。其主要化學成分有黃酮類、甾體類、酚酸類、木脂素、查爾酮和揮發(fā)油等[6]。近年來紅花抗缺血性腦卒中的作用受到關注，其主要通過抑制自由基的產(chǎn)生、抑制血栓形成、抑制細胞凋亡與炎性反應、保護神經(jīng)細胞、抗氧化能力以及通過調節(jié)一些信號通路等發(fā)揮腦保護作用[5,8]。但是，中藥發(fā)揮療效具有多成分、多靶點的特點，因此紅花抗缺血性腦卒中的機制也是多方面的，但現(xiàn)階段缺乏對紅花抗缺血性腦卒中的藥效成分及作用機制的整體認識。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術相結合的方法，通過構建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點”三者間網(wǎng)絡關系，并對紅花抗缺血性腦卒中疾病中作用較強的靶點進行驗證，從整體角度闡述紅花抗缺血性腦卒中的復雜關系，進而說明紅花多成分、多靶點、多通路的藥理作用機制。

1 資料

本研究使用的數(shù)據(jù)庫及軟件相關信息(見表1)。

表1 數(shù)據(jù)庫及軟件相關信息

2 方法

2.1 收集紅花活性成分、潛在靶點及轉換基因名

登錄中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)，選擇“Herb name”，輸入“honghua”進行檢索，以化合物口服藥物生物利用度(oralbioavail ability，OB)和類藥性(drug-like，DL)為標準，設置OB≥30%，DL≥0.18，將符合條件的成分導入Excel表，即得紅花活性成分。研究表明紅花中的活性成分羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)，對缺血性腦卒中具有神經(jīng)保護作用[9-12]。因此將HSYA也列在其中。將紅花活性成分對應的靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫中進行基因名的轉換，去除重復后獲得紅花活性成分對應的基因名。

2.2 篩選缺血性腦卒中疾病靶點

利用人類基因(Genecards)、人類孟德爾遺傳(OMIM)數(shù)據(jù)庫，以“ischemic stroke”作為關鍵詞檢索，去除重復后，得到與缺血性腦卒中相關靶點。從中篩選出評分大于15的缺血性腦卒中疾病靶點進行分析。

2.3 獲取共同靶點

將紅花活性成分對應靶點與缺血性腦卒中疾病對應靶點導入在線Venny中，繪制韋恩圖，得到紅花作用靶點與缺血性腦卒中疾病靶點的交集，即共同靶點。獲得紅花潛在治療缺血性腦卒中疾病作用靶點。

2.4 構建PPI網(wǎng)絡及篩選核心靶點

將Venny中篩選到的共同靶點，導入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”，隱藏離散節(jié)點，得到蛋白質之間的相互作用關系，獲得PPI網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點基因。利用Cytoscape 3.7.2將關鍵節(jié)點基因按degree值排列，繪制相關靶點網(wǎng)絡圖，并構建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點”三者間網(wǎng)絡關系圖，該網(wǎng)絡中有10個化合物能與5個及以上靶點發(fā)生相互作用。

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

將共同靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，構建可視化網(wǎng)絡。選擇“Homo sapiens”，進行GO功能和KEGG通路富集分析，設定P-value ≤0.05，篩選出符合條件的條目，對其進行可視化分析。GO富集分析主要包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞成分(cellular component，CC)相關過程，這些參與紅花治療缺血性腦卒中的整個過程。KEGG富集分析主要對信號通路進行富集，篩選出紅花治療缺血性腦卒中最可能的信號通路。

2.6 分子對接驗證

選擇共同靶點中degree值排名較高的靶點基因與“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點”網(wǎng)絡中排名靠前的活性成分進行分子對接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取紅花活性成分的分子結構mol2格式，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫將對應靶點基因轉換成3D分子結構pdb格式。通過Pymol 2.5.0對分子進行去水和剔除修飾配體，利用AutoDock Tools 1.5.6將紅花活性成分和靶點基因轉換為pdbqt格式。最后采用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接，通過Pymol 2.5.0獲得化合物的優(yōu)勢構象，運用Discovery Studio Visualize將分子對接得分較高且構象較穩(wěn)定的化合物與靶點基因進行可視化分析。

3 結果

3.1 紅花活性成分

通過篩選獲得紅花活性成分23種(見表2)。

表2 紅花23種活性成分信息表

續(xù)表2(Continued Tab.2)

3.2 獲取共同靶點

將23種紅花活性成分對應的靶點去除重復后導入Uniprot數(shù)據(jù)庫轉換基因名，共獲得459個靶點，利用Genecards數(shù)據(jù)庫篩選出評分大于15的缺血性腦卒中疾病靶點249個，在Venny中取交集得74個紅花潛在治療缺血性腦卒中疾病的作用靶點(見圖1)。

圖1 紅花與缺血性腦卒中靶點韋恩圖Fig.1 Wain diagram of the targets of safflower and ischemic stroke

3.3 構建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點”網(wǎng)絡圖及核心靶點篩選

將74個共同靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”，得到各靶點間相互作用網(wǎng)絡圖(見圖2)。將STRING數(shù)據(jù)庫中運行的結果導入Cytoscape 3.7.2中，對各靶點之間關系進行處理，依據(jù)degree值篩選出排名前20的靶點，繪制各靶點間相互作用關系圖，圖中圓圈大小表示靶點作用強度，圓圈越大，表明作用越強(見圖3)。將紅花、紅花活性成分和紅花與疾病共同作用靶點導入Cytoscape 3.7.2，構建“紅花-活性成分-腦缺血共同靶點”網(wǎng)絡圖(見圖4)。

圖2 紅花潛在治療缺血性腦卒中作用靶點PPI網(wǎng)絡圖Fig.2 PPI network of potential therapeutic targets of safflower for ischemic stroke

圖3 排名前20靶點間相互作用關系Fig.3 Interaction relationships among the top 20 targets

圖4 “紅花-活性成分-腦缺血共同靶點”網(wǎng)絡圖Fig.4 Network diagram of “safflower-active ingredient-cerebral ischemia common target”注：綠色節(jié)點表示紅花活性成分；黃色節(jié)點表示紅花與疾病共同作用靶點。Note:Green nodes represent active components of safflower;Yellow nodes represent common targets of safflower and disease.

3.4 GO功能及KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫和R語言，將74個潛在靶點進行GO功能及KEGG通路富集分析。通過GO富集分析，共得226個條目，其中BP條目170個，MF條目28個，CC條目28個；根據(jù)Count值由大到小的順序，分別選取前6個分析條目，BP中排名靠前的三個過程分別為RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、炎癥反應(inflammatory response)和基因表達的正調控(positive regulation of gene expression)，說明紅花治療缺血性腦卒中疾病的靶點主要與炎癥反應等密切相關(見圖5)。通過KEGG富集分析，共得92條信號通路，根據(jù)P-adjust和Count值對紅花治療缺血性腦卒中疾病的代謝通路進行分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17信號通路(見圖6)。

圖5 GO功能富集分析圖Fig.5 GO functional enrichment analysis diagram注：圖中藍色、黃色和綠色分別表示MF、BP和CC過程。Note:Blue,yellow and green represent MF,BP and CC processes respectively.

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖(排名前20)Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 20)注：圖中氣泡大小與顏色表示代謝通路富集程度，氣泡越大，顏色越深表明富集程度越高。Note:The bubble size and color in the figure indicate the enrichment degree of metabolic pathway.The larger the bubble,the deeper the color,and the higher the enrichment degree.

3.5 分子對接驗證

一般認為配體與受體結合，結合能越低，其構象越穩(wěn)定，結合能≤-4.25 kcal/mol提示有一定結合活性，≤-5.0 kcal/mol說明有較好結合活性，≤-7.0 kcal/mol表示有較強結合活性[13]。通過AutoDock Vina進行分子對接，對接結果如表3，利用Discovery Studio Visualize將紅花5種主要活性成分與關鍵靶點對接，將結合活性強的結果進行可視化處理(見圖7)。

圖7 紅花關鍵活性成分與靶蛋白對接可視化圖Fig.7 Visualization of the docking of key active components of safflower with target protein

4 討論與結論

缺血性腦卒中會造成一系列不利影響，包括氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)細胞凋亡和認知障礙等[1]。中醫(yī)認為中風的主要病機在于陰陽失調，氣血逆亂，治療原則多以祛風通絡、活血化瘀為主[14]。而紅花是我國傳統(tǒng)中藥，屬活血化瘀類，多見于活血化瘀類的復方中[15]。近年來在腦血管疾病中應用廣泛，但其作用機制仍不明確，因此本文首次采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術對紅花治療缺血性腦卒中機制進行探討。

通過網(wǎng)絡藥理學發(fā)現(xiàn)，紅花活性成分中槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、木犀草素(luteolin)和羥基紅花黃色素A(HSYA)作用靶點居多，是紅花的主要活性成分。其中槲皮素[16]、山奈酚[17]、豆甾醇[18]、木犀草素[19]、羥基紅花黃色素A[20]均具有抗炎抗氧化的作用，有作為炎癥反應和氧化應激輔助治療的潛力，山奈酚[17]和羥基紅花黃色素A[20]還具有抑制細胞凋亡，改善微循環(huán)，矯正受損代謝通路的作用。因此推測這些成分可能是紅花治療缺血性腦卒中的關鍵。

將靶點間相互作用關系進行分析，通過degree值篩選發(fā)現(xiàn)TNF、VEGFA、IL6、CXCL8、ICAM1和CCL2靶點與紅花活性成分作用關系強，是紅花治療缺血性腦卒中的關鍵靶點。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)對細胞間黏附分子1(ICAM1)的表達具有調節(jié)作用，可引發(fā)血管炎性，并誘導炎性細胞從血管內轉移至神經(jīng)組織[21]，白介素-6(IL-6)[22]、CXCL8[23]、趨化因子配體2(Chemokine ligand 2，CCL2)[24]在缺血性腦卒中后炎癥發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，而血管內皮生長因子A(VEGFA)[25]主要參與缺血性腦卒中后血管新生過程。通過GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17信號通路是紅花治療缺血性腦卒中的主要通路。PI3K-Akt是細胞內重要存活和抗凋亡的信號轉導通路[26]，AGE-RAGE信號通路可促進炎癥因子的表達和釋放，誘導細胞凋亡和促進血管新生[27]，HIF-1信號通路在急性腦缺血時可被激活，介導血管內皮生長因子VEGF的表達[28]，表明血管內皮生長因子在AGE-RAGE和HIF-1信號通路富集，且課題組前期研究表明HSYA通過刺激VEGF信號傳導可治療缺血性腦卒中[29]，這與網(wǎng)絡藥理學預測結果相一致。因此，紅花治療缺血性腦卒中是通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡和促進血管新生等作用。

表3 紅花關鍵活性成分與靶蛋白對接結果

通過分子對接技術進一步揭示紅花治療缺血性腦卒中疾病的作用機制，結果顯示關鍵靶點與紅花活性成分對接效果好，其中TNF與紅花5種主要活性成分的結合能均≤-7.0 kcal/mol，表明有較強結合活性，IL6與槲皮素、山奈酚、木犀草素也有較強結合活性，而CXCL8和VEGFA與槲皮素、山奈酚、木犀草素結合能均≤-5.0 kcal/mol，有較好結合活性。因此推測紅花主要活性成分與關鍵靶點結合可能是紅花發(fā)揮治療缺血性腦卒中的關鍵。

綜上所述，本研究從整體角度闡述紅花抗缺血性腦卒中的復雜關系，通過網(wǎng)絡藥理學的方法對紅花治療缺血性腦卒中機制進行分析，并運用分子對接技術對關鍵靶點進行驗證。研究發(fā)現(xiàn)紅花主要通過槲皮素、山奈酚和木犀草素等活性成分，作用于TNF、VEGFA、IL6、CXCL8等關鍵靶點，調節(jié)炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡和血管新生等作用，進而調控AGE-RAGE、TNF和IL-17等信號通路治療缺血性腦卒中。研究結果為紅花治療缺血性腦卒中作用機制提供理論指導，也為缺血性腦卒中的藥物研發(fā)提供參考。