申亞君，安 琪，丁笑穎，李恒陽(yáng)，郭 龍，鄭玉光,2，鄭 倩，張 丹*

1河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050200；2河北醫(yī)藥化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊 050026；3石家莊市中醫(yī)院，石家莊 050051

玉屏風(fēng)散首載于元代朱震亨的《丹溪心法》[1]，由防風(fēng)、黃芪、白術(shù)三味藥組成，在中醫(yī)方劑里有“玉屏組合少而精,芪術(shù)防風(fēng)鼎足行”的說(shuō)法。該方益氣，固表，止汗，用于表虛不固，自汗惡風(fēng)，面色晄白，或體虛易感風(fēng)邪者[2]。方中君藥黃芪性味甘溫，補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗[2]，具有抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、提高免疫功能、保護(hù)肺功能、保護(hù)腎組織、保護(hù)肝損傷、保護(hù)腸功能、調(diào)節(jié)血壓、抗衰老、防治骨質(zhì)疏松癥等作用[3]；臣藥白術(shù)味甘微溫，健脾益氣，燥濕利水[2]，白術(shù)可助君藥加強(qiáng)益氣之功；防風(fēng)為佐祛風(fēng)解表，勝濕止痛[2]。黃芪配白術(shù)，汗不外泄，外邪易難內(nèi)侵，該方以補(bǔ)氣藥為主，配合小量祛風(fēng)解表之品防風(fēng)，使補(bǔ)中寓散[4]。臨床上常用于治療氣虛體質(zhì)、有效減少反復(fù)上呼吸道感染頻率[5]、小兒哮喘[6]、慢性蕁麻疹、濕疹[7,8]、肝癌[9-11]。

目前關(guān)于玉屏風(fēng)散質(zhì)量分析的研究，已有部分文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，但飲片的質(zhì)量受產(chǎn)地、加工炮制方法等的影響，在臨床療效上也有一定的差異[15]。因此，本研究利用HPLC法建立了15批玉屏風(fēng)散的HPLC指紋圖譜，并對(duì)玉屏風(fēng)散中11種成分的含量進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，為建立玉屏風(fēng)散水煎液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、闡明玉屏風(fēng)散藥效機(jī)制以及指導(dǎo)臨床合理用藥提供了一定的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津制作所)；SPD-M20A紫外檢測(cè)器(日本島津制作所)；BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

乙腈為色譜純(Fisher Scientific Co.Ltd.)，甲醇為色譜純(Fisher Scientific Co.Ltd.)，正丁醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水。

對(duì)照品升麻素苷(批號(hào)PRF7040523、純度>98%)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)PRF8032744、純度>98%)、升麻素(批號(hào)PRF7090123、純度>98%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào)PRF7083021、純度>98%)、亥茅酚苷(批號(hào)PRF7083022、純度>98%)、毛蕊異黃酮(批號(hào)PRF7120844、純度>98%)、芒柄花素(批號(hào)PRF8032146、純度>98%)、芒柄花苷(批號(hào)PRF8032741、純度>98%)、白術(shù)內(nèi)酯I(批號(hào)PRF7071542、純度>98%)、白術(shù)內(nèi)酯II(批號(hào)PRF7080843、純度>98%)、白術(shù)內(nèi)酯III(批號(hào)PRF8032742、純度>98%)均購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。

15批黃芪飲片、防風(fēng)飲片、白術(shù)飲片分別購(gòu)于石家莊市內(nèi)各藥房，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院張丹副教授鑒定均為正品(見(jiàn)表1)。各飲片均符合《中國(guó)藥典》2020版項(xiàng)下性狀要求，鑒定結(jié)果黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricate(Turcz.) Schischk.的干燥根，白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖。將黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三種飲片分別粉碎過(guò)60目篩，按2∶2∶1的比例混合均勻，即得玉屏風(fēng)散樣品。

表1 15批次玉屏風(fēng)散飲片的產(chǎn)地信息

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取適量對(duì)照品，用甲醇溶解配制成含升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、芒柄花苷、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II的對(duì)照品混合溶液，濃度分別為1.725、1.010、1.110、1.530、1.290、1.010、2.050、0.990、2.090、2.035、2.005 mg/mL。

2.1.2 玉屏風(fēng)散供試品溶液

精密稱(chēng)取粉末約2.5 g，加50 mL甲醇超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液濃縮至干后，加水20 mL，用水飽和的正丁醇萃取四次，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液

分別按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制成缺黃芪、缺防風(fēng)、缺白術(shù)的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

Shimadzu Inertsil ODS-2 C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(見(jiàn)表2)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.3 玉屏風(fēng)散HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取玉屏風(fēng)散樣品(編號(hào)S1)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取同一玉屏風(fēng)散供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以1號(hào)峰(升麻素苷)為參照峰，測(cè)得其余17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取玉屏風(fēng)散樣品(編號(hào)S1)適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取同一玉屏風(fēng)散供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，以1號(hào)峰(升麻素苷)為參照峰，測(cè)得其余17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。結(jié)果表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)定玉屏風(fēng)散樣品(編號(hào)S1)2.5 g，平行6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，得玉屏風(fēng)散供試品溶液，依法進(jìn)樣，以1號(hào)峰(升麻素苷)為參照峰，測(cè)得其余17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立及相似度分析

取各批次玉屏風(fēng)散樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版)建立15批樣品指紋圖譜(圖1)，共標(biāo)示出24個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中11個(gè)峰。15批樣品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜相比較，各批次樣品的指紋圖譜相似度在0.835～0.965之間，表明玉屏風(fēng)散各批次間相似性較好(見(jiàn)表3)。

圖1 15批玉屏風(fēng)散HPLC指紋圖譜(S1～S15)和對(duì)照指紋圖譜(R)Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of Yupingfeng Powder (S1～S15) and referential fingerprint (R)

表3 15批玉屏風(fēng)散指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度比較

2.3.5 主要特征峰歸屬

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，與指紋圖譜各主要共有峰進(jìn)行對(duì)比，指認(rèn)出11個(gè)色譜峰，其中1號(hào)峰升麻素苷、2號(hào)峰毛蕊異黃酮葡萄糖苷、3號(hào)升麻素、4號(hào)峰5-O-甲基維斯阿米醇苷、5號(hào)峰亥茅酚苷、7號(hào)峰毛蕊異黃酮、9號(hào)峰芒柄花素、12號(hào)峰芒柄花苷、15號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯III、18號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯I、20號(hào)峰白術(shù)內(nèi)酯II。

2.4 11種成分含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成系列梯度濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的條件測(cè)定，記錄峰面積。將所得峰面積(Y)與各對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示各組分線性關(guān)系良好(見(jiàn)表4)。

表4 11種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取玉屏風(fēng)散粉末(編號(hào)S1)適量，按上述“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。計(jì)算各成分的相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。結(jié)果表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取玉屏風(fēng)散粉末(編號(hào)S1)精密稱(chēng)定2.5 g，平行6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，得玉屏風(fēng)散水煎液供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算各成分的相對(duì)峰面積的RSD<3.0%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)定11種成分含量已知的玉屏風(fēng)散粉末樣品1.25 g，平行6份，分別加入對(duì)照品溶液適量，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算11個(gè)成分的加樣回收率的平均回收率分別為98.31%、99.27%、95.99%、102.75%、101.68%、98.63%、98.79%、97.99%、98.21%、101.36%、96.89%，RSD分別為2.7%、1.9%、2.3%、1.7%、2.5%、1.7%、1.9%、1.7%、2.9%、2.7%、2.1%。

2.4.6 樣品含量測(cè)定

按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備15批玉屏風(fēng)散供試品及陰性樣品，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，混合對(duì)照品、樣品色譜圖及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖2。通過(guò)與陰性樣品色譜圖對(duì)比，可以判定2、7、9、12號(hào)峰存在于黃芪飲片中，1、3、4、5號(hào)色譜峰存在于防風(fēng)飲片中，15、18、20號(hào)色譜峰主要存在于白術(shù)飲片中，含量結(jié)果見(jiàn)表5。

圖2 混合對(duì)照品(A)、黃芪陰性樣品(B)、防風(fēng)陰性樣品(C)、白術(shù)陰性樣品(D)和玉屏風(fēng)散(E)的HPLC圖Fig.2 HPLC of mixed reference (A),negative sample without Astragali Radix (B),negative sample without Saposhnikoviae Radix (C),negative sample without Atractylodis Macrocephalae Rhizoma (D),and Yupingfeng Powder (E)

表5 玉屏風(fēng)散中11種成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.5 基于化學(xué)計(jì)量學(xué)的玉屏風(fēng)散水煎液質(zhì)量分析

2.5.1 聚類(lèi)分析

以15批玉屏風(fēng)散中的11個(gè)成分的含量為變量，組成11×15數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SPSS 23.0軟件中，采用組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類(lèi)法，以平方歐式距離為測(cè)度進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)類(lèi)間距離為25時(shí)，15批樣品可聚為兩類(lèi)，S1、S2、S3、S4、S7、S8、S10、S11、S12、S13為第Ⅰ類(lèi)，S5、S6、S9、S14、S15為第Ⅱ類(lèi)。結(jié)果表明，不同批次的樣品主要成分的含量存在一定的差異，這可能與生產(chǎn)飲片所用藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)以及加工炮制有一定的關(guān)系，也反映出中藥飲片質(zhì)量的差異。

圖3 15批玉屏風(fēng)散聚類(lèi)樹(shù)狀圖Fig.3 Dendrogram of 15 batches of Yupingfeng Powder

2.5.2 主成分分析

以15批玉屏風(fēng)散樣品中11個(gè)成分的含量為變量，采用SIMCA-P 13.0軟件對(duì)15批玉屏風(fēng)散樣品進(jìn)行PCA分析，前兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率66.0%，即可以用2個(gè)潛在綜合指標(biāo)來(lái)解釋66.0%的總方差，可反映不同批次的玉屏風(fēng)散的質(zhì)量差異(見(jiàn)圖4)。15批玉屏風(fēng)散樣品被分成2類(lèi)，與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致，究其原因?yàn)楦髋螛悠分g的質(zhì)量差異所導(dǎo)致。

圖4 樣品PCA得分圖Fig.4 PCA score scatter plot of 15 batches of Yupingfeng Powders

2.5.3 正交偏最小二乘法

為確定影響玉屏風(fēng)散的潛在化學(xué)指標(biāo)，本研究繼續(xù)采用正交偏最小二乘法(OPLS-DA)對(duì)15批樣品中的11種成分的含量組成的變量進(jìn)行分析。與PCA分析結(jié)果一致，15批玉屏風(fēng)散樣品被分為兩類(lèi)(見(jiàn)圖5)，R2X= 0.968，R2Y=0.964和Q2= 0.854，表面所建立的模型具有很好的預(yù)測(cè)能力。為了選擇化學(xué)標(biāo)記，基于投影(VIP)值的可變重要性進(jìn)一步篩選11個(gè)成分。VIP代表變量的差異，當(dāng)VIP>1.0時(shí)，即代表該成分是分化中起重要作用的組分。結(jié)果顯示，升麻素苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的VIP>1.0，說(shuō)明這5種成分對(duì)玉屏風(fēng)散整體質(zhì)量影響較大(見(jiàn)圖6)。

圖5 樣品OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA score scatter plot of 15 batches of Yupingfeng Powders

圖6 樣品各成分的VIP圖Fig.6 VIP values of 15 batches of Yupingfeng Powders

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化玉屏風(fēng)散供試品溶液提取方式時(shí)，同時(shí)對(duì)比了超聲、回流、連續(xù)回流三種提取方法，以玉屏風(fēng)散色譜圖中色譜峰的數(shù)量、分離度及定量測(cè)定的11種目標(biāo)成分的提取率為指標(biāo)分析，色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD<3.0%，其總提取率有較大差異，其中超聲和索提兩種方式所得物質(zhì)含量較大，但是索提耗時(shí)較長(zhǎng)，最后綜合考慮采用超聲方法進(jìn)行提取。

實(shí)驗(yàn)中考察了甲醇-水、乙腈-水等不同流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水干擾較小且分離效果較好，分析時(shí)間短，且梯度洗脫過(guò)程中基線平穩(wěn)，因此選擇乙腈-水為流動(dòng)相。

對(duì)11個(gè)化合物分別在230、254、276、300、320 nm，5個(gè)波長(zhǎng)下檢測(cè)的色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果黃芪在230 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下檢出的特征峰相對(duì)較多且峰分離度高，有最大吸收；防風(fēng)在230、254 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下檢出的特征峰數(shù)量基本一致；白術(shù)則在230 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下有最大吸收，且白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在其他波長(zhǎng)下吸收較弱，因此采用了230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)建立了15批玉屏風(fēng)散的HPLC指紋圖譜，選取黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、芒柄花素，防風(fēng)中的升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、和白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯II為主要定量指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，并采用HCA、PCA和OPLS-DA等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法考察了不同批次玉屏風(fēng)散的整體性與差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15個(gè)批次的樣品HPLC指紋圖譜相似度在0.835～0.965之間，HCA和PCA分析結(jié)果基本一致，將樣品分為兩大類(lèi)，結(jié)合飲片產(chǎn)地信息發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ類(lèi)中飲片多來(lái)自?xún)?nèi)蒙等地區(qū)，第Ⅱ類(lèi)樣品中飲片則多來(lái)自浙江等地，南北方在土壤、氣候及栽培方式上均有很大不同，且各藥店飲片來(lái)源于不同產(chǎn)地的不同飲片加工廠，道地中藥材及優(yōu)良產(chǎn)地是影響飲片質(zhì)量的關(guān)鍵因素,中藥材因受不同生長(zhǎng)環(huán)境影響所含有效成分有所不同[16]。因此飲片質(zhì)量與中藥飲片生產(chǎn)所需的藥材產(chǎn)地、采收加工的季節(jié)與加工炮制有一定的相關(guān)性。本研究所建立的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可對(duì)藥品生產(chǎn)企業(yè)在原藥材及制備過(guò)程中提供參考依據(jù)，有利于玉屏風(fēng)散的臨床合理運(yùn)用。