孟令帥，曹 森，彭 琳，馬立志，孟憲軍，周笑犁*

1貴陽學院食品與制藥工程學院，貴陽550005；2沈陽農業(yè)大學食品學院，沈陽110866

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又叫老年性癡呆，是一種進行性神經退行性疾病，能夠導致記憶喪失，認知功能障礙，行為障礙，社會障礙，并且是癡呆的最常見原因[1,2]。據估計，全世界有2 400萬人患有癡呆癥，其中大多數(shù)人患有阿爾茨海默病[3]。此外，阿爾茨海默病是一種常見的與年齡相關的疾病，最常見于65歲或以上的人群[4,5]。因此，阿爾茨海默病仍然是人口老齡化的主要健康問題之一，阿爾茨海默病病例在未來幾十年注定會顯著增長。目前，有幾種假設可以解釋阿爾茨海默病的發(fā)病機制，包括β-淀粉樣蛋白(Aβ)肽和tau蛋白過度磷酸化，這些在阿爾茨海默病的發(fā)病機制中起主要作用[6]。此外，越來越多的證據表明氧化應激和細胞凋亡在阿爾茨海默病中起關鍵作用[7]。相關研究表明，AD患者的氧化應激能夠導致細胞凋亡[8,9]。同時，氧化應激能夠激活細胞保護機制，包括內源性抗氧化劑和抗氧化酶系統(tǒng)。參與這種保護作用的主要抗氧化酶是血紅素氧合酶-1(HO-1)，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)。抗氧化酶基因的轉錄激活主要受核轉錄相關因子(Nrf2)[10]的調節(jié)。一些植物化學物質可以激活Nrf2/抗氧化反應元件(ARE)信號，從而上調抗氧化酶的表達，增強神經元對氧化應激的抵抗力[11]。在靜息狀態(tài)下，Nrf2以復合物的形式存在。當復合物被破壞時，Nrf2易位至細胞核并與ARE序列結合以促進抗氧化酶的表達。已知Aβ的細胞外沉積會導致神經元的氧化損傷和細胞凋亡，并且Aβ也被證明可誘導ROS和過氧化氫(H2O2)過量產生，并降低SOD和GSH-Px水平，從而導致氧化應激[12]。

目前，花色苷對于阿爾茨海默病的預防、保護等作用已經取得了一定的研究進展。Heo等[13]研究了草莓花色苷對阿爾茨海默病細胞模型的神經保護活性。研究表明，草莓花色苷能夠減少氧化應激的發(fā)生以及氧化應激誘導的細胞凋亡，從而能夠對神經細胞起到保護的作用。Badshah等[14]研究了黑大豆中花色苷對Aβ1-42誘導的神經退行性細胞和動物模型的神經保護作用。研究表明了花色苷通過維持Ca2+穩(wěn)態(tài)，有效的減少神經細胞凋亡，對神經細胞能夠起到保護作用。Meng等[15]研究了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對阿爾茨海默病細胞模型的保護作用。結果表明矢車菊素-3-O-葡萄糖苷能夠通過調節(jié)細胞抗氧化和凋亡相關基因來保護阿爾茨海默病細胞免受Aβ1-40誘導的氧化應激和細胞凋亡。以上研究說明了花色苷可能成為AD等神經退行性疾病的潛在候選藥物。此外，最近Isaak等[16]的研究發(fā)現(xiàn)由矢車菊-3-O-半乳糖苷，矢車菊-3-O-葡萄糖苷和矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷組成的越橘花色苷能夠保護心肌細胞免受氧化應激及細胞凋亡產生的損傷。先前的研究表明了黑果腺肋花楸中花色苷含量非常高，結構簡單，主要由矢車菊-3-O-半乳糖苷，矢車菊-3-O-葡萄糖苷，矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷及矢車菊-3-O木糖苷組成[17]，高純度的花色苷相對更容易分離出來。因此，我們選擇高純度的黑果腺肋花楸花色苷來研究對氧化應激相關的阿爾茨海默病的預防和保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗所需高純度花色苷請參考Meng等[17]；β淀粉樣肽(1-42)(Aβ1-42,北京博奧森生物技術有限公司)；DMEM(10565-018)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS,10099-141)、gluta max(35050061)(美國Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO)(D8371，上海索萊寶公司)；2，3-二甲氧基-1，4-萘醌購(D5439-5MG)、H2O2檢測試劑盒(29300)(中國碧云天公司)；SOD檢測試劑盒(19160)、annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(APOAF-20TST)(美國Sigma公司)；Nrf2抗體(ab62352)、HO-1抗體(ab13248)、NQO1抗體(ab28947)、Bcl-2抗體(ab196495)、Bax抗體(ab32503)、GAPDH內參抗體(Sc-32233)、山羊抗兔IgG H&L (HRP,Ab6721)、山羊抗鼠IgG H&L(HRP,Ab6789)(英國Abcam公司)；BCA蛋白質測定試劑盒(WLA004,沈陽萬類生物有限公司)；試驗所需引物(沈陽匯佰生物科技有限公司)；TRIzol、TaKaRa試劑盒(美國Gibco公司)；SH-SY5Y細胞(中科院上海細胞庫)。

1.2 主要儀器設備

倒置顯微鏡(中國奧林巴斯有限公司)；H-2050R型超速冷凍離心機(湖南湘儀離心機有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海SYSBERY儀器有限公司)；iMarkTM型酶標儀(美國Bio-Rad有限公司)；Mini-PROTEAN?Tetra型垂直蛋白電泳儀(美國Bio-Rad有限公司)；5200型凝膠成像系統(tǒng)(上海Tianon有限公司)；ExicyclerTM 96型熒光定量儀(韓國BIONEER有限公司)。

1.3 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)及分組

SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含有5% CO2、10% FBS的37 ℃ DMEM培養(yǎng)基中，經過復蘇、傳代，然后保存于4 ℃?zhèn)溆?。?00 g的溶解于10 mL的DMSO中，得到20 mg/mL的花色苷原液并儲存于4 ℃?zhèn)溆?。? mg的Aβ1-42溶解于1.8 mL的DMSO中制成257 mM的原液并儲存于4 ℃?zhèn)溆??；ㄉ占癆β1-42的濃度的篩選，細胞給藥及細胞分組參考Meng等[18]的方法，細胞主要分組如下。

對照組：SH-SY5Y細胞在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)24 h。

模型組(Aβ1-42組)：將Aβ1-42提前一天放入含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃老化24 h，然后加入SH-SY5Y細胞中，在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h，終濃度為1 μM。

低劑量藥物保護組、中劑量藥物保護組以及高劑量藥物保護組分別先用20、40、60 μg/mL花色苷預處理SH-SY5Y細胞24 h，在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用1 μM Aβ1-42處理，繼續(xù)在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h。所述Aβ1-42已在37 ℃下老化24 h。

1.4 氧化應激相關指標的測定

1.4.1 細胞內ROS(reactive oxygen species)的檢測

采用2，3-二甲氧基-1，4-萘醌對SH-SY5Y細胞進行染色，使用熒光顯微鏡觀察細胞內ROS水平。簡而言之，將生長良好且沒有污染的SH-SY5Y細胞棄去培養(yǎng)基，用適量PBS清洗細胞表面，并棄去PBS，然后在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中用適量胰蛋白酶消化細胞。待消化完成后，用胰酶2倍體積的完全培養(yǎng)基中止消化，并吹打培養(yǎng)瓶瓶底，將細胞移入離心管，1 000 rpm離心5 min，去掉上清液，加1 mL完全培養(yǎng)基吹打混勻細胞(沿壁輕輕吹打24次左右)，每孔放入3×105個細胞，過夜，根據試驗分組對細胞進行給藥，過夜。爬片的細胞PBS 2 mL浸洗2次，將2，3-二甲氧基-1，4-萘醌母液稀釋100倍，對已放置在蓋玻片上的細胞染色15 min，PBS 2 mL浸洗2次，載玻片滴加一滴甘油，將染色好的蓋玻片反扣于甘油上(細胞面朝下蓋到載玻片上)，透明指甲油封片，熒光顯微鏡200倍觀察，拍照。

1.4.2 細胞內超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的檢測

采用SOD測定試劑盒對細胞內SOD進行檢測，每個濃度收集1×106個細胞，用100 μL含1%蛋白酶抑制劑的PBS稀釋，并12 000 rpm離心10 min，取上清。準備96孔板，每個樣品分為樣品孔和三個空白孔，空白孔1、空白孔2、空白孔3。樣品孔和空白孔2加入20 μL樣品，在空白孔1和空白孔3中加入20 μL ddH2O；每孔加入200 μL WST working solution，并混勻。在空白孔2和空白孔3中加入Dilution Buffer 20 μL。在空白孔1和樣品孔中加入20 μL Enzyme Working Solution。37 ℃孵育20 min，酶標儀450 nm處進行讀數(shù)。計算公式為：

SOD活性={[(S1-S3)-(SS-S2)]/(S1-S3)}×100%

SS：樣品孔的吸光度值；S1：空白孔1的吸光度值；S2：空白孔2的吸光度值；S3：空白孔3的吸光度值。

1.4.3 細胞內H2O2的檢測

簡而言之，將SH-SY5Y細胞在裂解緩沖液中裂解并以12 000 rpm離心10 min，棄去沉淀，將上清液儲存在-20 ℃，使用BCA蛋白質定量測定試劑盒定量蛋白質含量。用H2O2檢測試劑盒測量細胞內H2O2水平，并根據標準曲線計算，樣品中H2O2濃度表示為μmol/g蛋白質。

1.5 Annexin-V-PI/FITC 檢測細胞凋亡

采用Annexin V-PI/FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。簡而言之，用PBS洗滌細胞，然后棄去PBS。在37 ℃的培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶消化細胞。然后用完全培養(yǎng)基終止消化，并將細胞轉移到離心管中。將細胞以1 000 rpm離心5 min，棄去上清液。吹打細胞并與1 mL培養(yǎng)基混合，向每個孔中加入1×106個細胞并放入培養(yǎng)箱中過夜。根據實驗組處理細胞并在孵育24 h后收集。用1×結合緩沖液將細胞懸浮至1×106/mL，并將500 μL細胞懸浮液加入與5 μL Annexin V FITC和10 μL PI混合于每個流動管中。最后，將反應體系在室溫下避光孵育，并使用BD C6流式細胞儀進行檢測。

1.6 蛋白質印跡(Western blot)

根據試驗分組對SH-SY5Y細胞進行給藥處理。根據文獻所述提取蛋白質[14]。采用BCA蛋白質定量測定試劑盒測定蛋白質水平，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，并將其轉移到PVDF膜，將膜用PBST浸泡，在室溫下轉移到封閉溶液中1.5 h，然后與PBST稀釋的一抗鈣調蛋白、細胞色素c、caspase-9、裂解的caspase-3、Bcl-2、Bax等抗體(抗體信息見表1)在4 ℃培養(yǎng)過夜(GAPDH為內參蛋白)。將膜與二抗以1∶2 000的稀釋度按照上述方式制備，室溫孕育1.5 h，然后用PBST洗滌三次，大約10 min。采用ECL顯色試劑盒進行化學發(fā)光反應，用ECL發(fā)光儀器觀察條帶，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行光密度分析。

表1 抗體

1.7 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，PBS洗滌細胞表面，棄去PBS，然后在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中用胰蛋白酶消化細胞，消化完成后，使用完全培養(yǎng)基終止消化，吹打培養(yǎng)瓶底部，將細胞轉移到離心管中，1 000 rpm離心5 min，棄去上清液，用1 mL完全培養(yǎng)基反復洗滌細胞三次并用其混合，然后在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。根據試驗分組對SH-SY5Y細胞進行給藥處理，并將其置于含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)24 h，然后收集。使用TRIzol從培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞中提取總RNA，并使用TaKaRa試劑盒進行逆轉錄。以通過反轉錄獲得的cDNA為模板，采用熒光定量PCR儀進行擴增，反應體系為20 μL，其中，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μM)(見表2)各0.5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，然后ddH2O補足至20 μL。反應條件為95 ℃，10 min，(95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，30 s)共40個循環(huán)，4 ℃，5 min。最后采用Exicycler 96實時定量熒光檢測器進行RT-PCR分析。

表2 熒光定量PCR所用引物

1.8 數(shù)據統(tǒng)計與分析

采用Excel軟件計算平均值和標準差。采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析(ANOVA)法進行組間差異顯著性分析，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 細胞內ROS的測定

由圖1的結果我們可以看出，與對照組(control)相比，模型組(Aβ1-42)中的氧自由基明顯增多，說明Aβ1-42能夠誘導SH-SY5Y細胞產生氧化應激。此外，與模型組相比，藥物保護組中的氧自由基明顯減少，而且，隨著藥物保護組中花色苷(anthocyanins，Ant)劑量的升高，細胞中的氧自由基也不斷降低。其中，高劑量藥物保護組(Aβ1-42+Ant(60 μg/mL))細胞中的氧自由基含量最少，對細胞的保護作用最好。說明Ant能夠削弱Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞產生的氧化應激，能夠對細胞起到保護作用。

圖1 細胞內ROS的測定Fig.1 The determination of intracellular ROS注：紅色：氧自由基生成增多；藍色：抗氧化作用增加，氧自由基受抑制；G1：對照組；G2：模型組；G3：花色苷干預組(20 μg/mL)；G4：花色苷干預組(40 μg/mL)；G5：花色苷干預組(60 μg/mL)，下同。Note:Red:oxygen free radical production increased;Blue:antioxidant effect increased and oxygen free radical was inhibited;G1:Control group;G2:Model group (Aβ1-42);G3:Aβ1-42+Ant (20 μg/mL);G4:Aβ1-42+Ant (40 μg/mL);G5:Aβ1-42+Ant (60 μg/mL),the same below.

2.2 細胞內SOD的測定

由圖2的結果可以看出，與對照組相比，模型組的SOD活性顯著低于對照組(P<0.05)，大約降低16.24%。與模型組相比，藥物保護組中隨著花色苷含量的升高，SOD的活性逐漸顯著升高(P<0.05)，其中，高劑量藥物保護組(Aβ1-42+Ant(60 μg/mL))的SOD活性最高為99.54%，與模型組相比，SOD活性升高了23.24%。

圖2 細胞內SOD的測定Fig.2 The determination of intracellular SOD注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

2.3 細胞內H2O2的測定

從圖3可以看出，與對照組相比，模型組(Aβ1-42)細胞內H2O2的產生顯著增加(P<0.05)，表明Aβ1-42可誘導H2O2的產生。此外，在藥物保護組中，隨著花色苷濃度的增加，細胞內H2O2的產生與模型組相比顯著降低(P<0.05)。當花色苷濃度為60 μg/mL時，與對照組相比，細胞內H2O2的產生無明顯變化(P>0.05)。這些結果表明，黑果腺肋花楸花色苷可以減少SH-SY5Y細胞中Aβ1-42誘導的H2O2的產生。

圖3 細胞內H2O2的測定Fig.3 The determination of intracellular H2O2注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

2.4 細胞凋亡的檢測

從圖4和表3可以看出，與對照組相比，模型組中早期細胞凋亡率增加了3.3%，晚期細胞凋亡率增加了4.5%，細胞總凋亡率增加了7.8%，表明Aβ1-42可誘導SH-SY5Y細胞凋亡。與模型組相比，在藥物保護組中，隨著藥物保護組中花色苷含量的增加，早期凋亡率，晚期凋亡率和總細胞凋亡率逐漸降低。當花色苷濃度為60 μg/mL時，與模型組相比，總細胞凋亡率下降了8.3%。這些結果表明，黑果腺肋花楸花色素苷預處理能夠有效的削弱Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞產生的細胞凋亡。

表3 SH-SY5Y細胞凋亡

圖4 SH-SY5Y細胞凋亡Fig.4 The apoptosis in SH-SY5Y cell

2.5 蛋白印記分析

通過蛋白質印跡分析Nrf2相關抗氧化蛋白及凋亡相關蛋白表達，結果顯示在圖5中。與對照組相比，Aβ1-42組中Nrf2、HO-1、NQO1、Bax蛋白表達上調，Aβ1-42組Bcl-2蛋白表達下調。在藥物保護組中，隨著花色苷濃度的增加，與模型組相比，Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表達逐漸上調，Bax蛋白的表達逐漸下調，當花色苷濃度為60 μg/mL時，Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表達量最高，Bax蛋白的表達量最低。此外，當花色苷濃度為20 μg/ mL時，與對照組相比，Bcl-2蛋白表達略有下調，之后隨著花色苷濃度的增加，Bcl-2蛋白表達逐漸上調。當花色苷濃度為60 μg/mL時，Bcl-2蛋白表達量最高。這些結果說明花色苷能夠激活Nrf2，使其轉入細胞核內促進HO-1及NQO1蛋白的表達。此外，花色苷也能夠促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制促凋亡蛋白Bax的表達。

圖5 Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞中的凋亡相關蛋白的蛋白印記分析Fig.5 Western blot analysis of apoptotic-related proteins in Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells

2.6 RT-PCR分析

通過RT-PCR檢測Nrf2相關基因和凋亡相關基因的轉錄，詳細結果見圖6。從圖中可以看出，與對照組相比，Aβ1-42組中Nrf2、HO-1、NQO1和Bax相對mRNA表達顯著上調(P<0.05)，Aβ1-42組中Bcl-2相對mRNA表達顯著下調(P<0.05)。在藥物保護組中，與模型組相比，當花色苷濃度為20 μg/mL時，Nrf2相對mRNA表達下降0.095，隨著花色苷濃度的繼續(xù)增加，Nrf2相對mRNA表達與模型組相比顯著上調(P<0.05)。當花色苷濃度為20 μg/mL時，NQO1、Bcl-2相對mRNA表達與模型組相比無顯著變化(P>0.05)，隨著花色苷濃度的繼續(xù)增加，NQO1、Bcl-2相對mRNA表達相比于模型組顯著上調(P<0.05)。此外，隨著花色苷濃度的增加，與模型組相比，HO-1相對mRNA表達顯著上調(P<0.05)，Bax顯著下調(P<0.05)。

3 討論與結論

氧化應激產生的ROS直接或間接地損傷細胞內蛋白質、脂質、核酸等大分子物質的生理功能，是眾多疾病發(fā)生的病理生理基礎。機體在應對氧化應激的發(fā)生時形成了一套復雜的氧化應激應答系統(tǒng)來應對自由基和有毒物質的損害，當暴露于親電子試劑或活性氧刺激時，機體自身能誘導出一系列的保護性蛋白，以緩解細胞所受的損害[19]。這一協(xié)調反應是由保護性蛋白DNA 上游調節(jié)區(qū)的抗氧化反應元件(antioxidant responsive element，ARE)來調控的。研究表明，核轉錄相關因子Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通過與ARE 相互作用調節(jié)編碼抗氧化蛋白，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內源性抗氧化應激通路[20]。先前的研究已經表明了花色苷因其較強的抗氧化能力，能夠清除體內自由基，降低氧化應激水平，保護機體免受氧化應激造成的損傷[21-23]。隨著研究的進一步深入，研究表明花色苷能夠通過Nrf2信號通路上調相關抗氧化酶的表達，降低氧化應激水平，從而保護阿爾茨海默病細胞或者動物模型免受氧化應激引起的損傷[24]。

圖6 RT-PCR對Aβ1-42引誘的SH-SY5Y細胞中相對mRNA表達分析Fig.6 The relative mRNA expression analysis using Real Time-PCR in Aβ1-42-induced SH-SY5Y cells注：小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant difference (P<0.05).

此外，細胞凋亡經常伴隨氧化應激的發(fā)生而發(fā)生，并且哺乳動物細胞中的細胞凋亡通過外在和內在途徑進行。外在途徑涉及細胞外信號因子與質膜中死亡受體的結合[25]。內在途徑由細胞內應激激活并通過線粒體進行。線粒體凋亡途徑受Bcl-2家族的調節(jié)，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-xL，以及促凋亡蛋白如Bax和Bak[26]。近年來，研究表明氧化應激和細胞凋亡促進了AD的發(fā)展。因此，發(fā)掘可以預防神經元氧化損傷和凋亡的生物活性物質，從而有助于預防和控制AD，具有重要的研究意義。

在前言中已經介紹了，目前一些研究已經報道花色苷能夠通過減少氧化應激的發(fā)生以及氧化應激誘導的細胞凋亡從而對阿爾茨海默病起到預防和保護的作用。因此本研究采用Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞構建阿爾茨海默病細胞模型系統(tǒng)，選擇ROS、SOD、H2O2作為氧化應激相關指標，通過Nrf2信號通路研究花色苷對氧化應激及細胞凋亡的保護作用，評價花色苷的細胞保護作用。結果表明了黑果腺肋花楸花色苷能夠激活Nrf2代謝通路，上調HO-1、NQO1基因mRNA及蛋白的表達，從而上調HO-1、NQO1、SOD等相關抗氧化酶的表達，降低細胞內的氧化應激水平。同時，黑果腺肋花楸花色苷還能夠上調Bcl-2基因及蛋白的表達，下調Bax基因及蛋白的表達，從而降低細胞的凋亡。因此，黑果腺肋花楸花色苷能夠有效保護阿爾茨海默病免受Aβ1-42誘導SH-SY5Y細胞產生的氧化應激及細胞凋亡。先前的關于花色苷對阿爾茨海默病影響的研究大多數(shù)采用的花色苷均為粗提物或者混合物，而本次研究采用的花色苷混合物結構簡單明確，并且純度達到93%以上，更能夠說明花色苷對阿爾茨海默病的作用，這對于花色苷及其相關產品的進一步開發(fā)具有重要的意義。