張應(yīng)

近年來(lái)藥理學(xué)研究表明墊狀卷柏具有多種藥理學(xué)活性，其中抗腫瘤活性具有特異性得到關(guān)注和重視[1-3]。本課題組前期對(duì)墊狀卷柏提取物(Selaginelpulvinate extracts，SP) 的抗腫瘤活性進(jìn)行系統(tǒng)性的篩選，發(fā)現(xiàn)SP對(duì)人白血病細(xì)胞系K562的體外細(xì)胞增生抑制作用最強(qiáng)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，筆者開(kāi)展了SP對(duì)K562腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制的研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及藥材 K562腫瘤細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)提供。墊狀卷柏購(gòu)于安徽亳州滕王藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1907003，為全草干燥狀態(tài)。

1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；膜聯(lián)蛋白V/碘化吡啶(Annexin V/PI)試劑盒(BD)；滅菌胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥化試)。

1.3 儀器 超聲波清洗儀(KQ-500，昆山市超聲儀器有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermofisher公司)；生物安全柜(美國(guó)LABCONCO公司)；CKX41型倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)；FACsc-alibur型流式細(xì)胞儀(Beeton-Diekinson公司)；臺(tái)式離心機(jī)(Anke TDL-40型，上海安亭科學(xué)儀器廠)；壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KB，安海申安醫(yī)療器械廠)。

1.4 SP的制備 稱取適量墊狀卷柏干燥的全草，粉碎過(guò)40目篩備用。稱取100 g狀卷柏干燥全草粉末，以75%乙醇作為提取溶劑(料液比1∶20)，浸提24 h后，超聲提取20 min，提取溫度40 ℃，真空抽濾后濾渣重復(fù)上操作2次，最后合并濾液，旋蒸濃縮后并減壓干燥成干粉。實(shí)驗(yàn)臨用前用75%乙醇溶解得到高濃度的母液，0.22 μm濾膜過(guò)除濾后待用，給藥時(shí)用PBS溶液稀釋至所需的濃度。最高給藥濃度組所用的藥液中乙醇濃度均小于0.3%，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明含0.3%乙醇的PBS組與PBS空白組相比較，對(duì)本研究所涉及腫瘤細(xì)胞株的吸光度均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明含0.3%乙醇的PBS對(duì)本研究中所有腫瘤細(xì)胞株的增生無(wú)影響。

1.5 SP對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人慢性髓系K562腫瘤細(xì)胞，重懸后以5×105個(gè)/mL濃度接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后吸棄原培養(yǎng)液，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液和10 μL 不同濃度的SP 溶液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔并另設(shè)PBS空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次，懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL；先加入5 μL Annexin V試劑，混合均勻，然后再加入5 μL PI試劑，混合均勻，孵育15 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP對(duì)K562腫瘤細(xì)胞凋亡的影響 與PBS空白對(duì)照組相比較，不同濃度組SP作用于K562細(xì)胞36 h 后細(xì)胞凋亡率均有不同程度的增加，其中50 μg/mL和100 μg/mL濃度組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；不同濃度組的凋亡情況存在良好的劑量相關(guān)性：以SP濃度為縱坐標(biāo)，K562細(xì)胞凋亡率為橫坐標(biāo)，回歸直線方程的r值為99%。結(jié)果表明SP能有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 細(xì)胞凋亡圖

表1 SP對(duì)K562細(xì)胞腫瘤凋亡的影響(±s)

表1 SP對(duì)K562細(xì)胞腫瘤凋亡的影響(±s)

注：與PBS空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別 凋亡率(%)PBS空白對(duì)照組 1.01±0.15 SP給藥組5 μg/mL 25 μg/mL 2.36±0.72 4.04±0.29 50 μg/mL 10.92±0.21*100 μg/mL 24.73±0.38*

3 討論

卷柏屬植物作為民間傳統(tǒng)草藥被用于腫瘤方面的治療，其中卷柏屬植物中的墊狀卷柏被中國(guó)藥典收錄，主治經(jīng)閉痛經(jīng)，跌打損傷等癥，其成分較為復(fù)雜，主要有雙黃酮類、炔酚類、苯丙素類、生物堿類等[4-5]。

本課題組前期對(duì)SP在不同系列腫瘤細(xì)胞系的增生活性進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)對(duì)人白血病細(xì)胞系的敏感性最高，因此在筆者選取對(duì)SP敏感性最高的K562腫瘤細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。近年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2，6-10]，SP能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抑制腫瘤增生作用的，其機(jī)制可能是Caspase途徑的激活從而導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)減弱有一定關(guān)系，有研究表明[11-15]SP對(duì)Bax mRNA表達(dá)有明顯上調(diào)作用，Bcl-2 mRNA表達(dá)存在明顯下調(diào)作用，從而抑制Bcl-2表達(dá)，且有劑量依賴性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究也證實(shí)SP抗腫瘤活性的可能機(jī)制是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但具體分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究和探討。

綜上所述，SP通過(guò)誘導(dǎo)K562腫瘤細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤的目的。