鄭立娟 陳小婕 楊巖 史新龍 吳燾 張生琰

納豆激酶(NK)是一種納豆菌在發(fā)酵過程中由枯草芽孢桿菌分泌生成的具有高效溶栓效果的纖維蛋白酶，具有抗血栓、抗菌、抗氧化、降血壓、降血脂等多種作用[1]。目前，臨床常見的急性心肌梗死、腦血栓中風(fēng)、脈管栓塞等多種嚴(yán)重的心血管疾病均由血栓引發(fā)，這些疾病好發(fā)于中老年人群，對(duì)中老年患者的身體健康構(gòu)成極大的威脅[2]。據(jù)報(bào)道，全球范圍內(nèi)目前有1 500萬以上的血栓患者，溶栓劑的潛在市場(chǎng)值達(dá)20億美元之多[3]。然而臨床上常用的鏈激酶、尿激酶、重組組織型纖溶酶原激活物等溶栓劑均存在價(jià)格昂貴、副作用大、半衰期短等缺點(diǎn)，制約了在臨床上的廣泛應(yīng)用。NK具有溶栓效果好、起效快、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、安全性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有用于開發(fā)新型溶栓劑的潛力[4]。NK溶栓作用有幾種不同的給藥方式，各自有各自的優(yōu)點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)探討通過十二指腸給藥的途徑應(yīng)用NK對(duì)大鼠腦血栓的溶栓作用，結(jié)果如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量360～450 g。

1.2 儀器 ①醫(yī)用牙科鉆。②漩渦混合器，型號(hào)：QL-901，由上海市麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)。③振蕩培養(yǎng)箱，型號(hào)：SPX-250B-D型，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.3 藥物試劑 ①納豆激酶凍干粉(NK酶粉)，由北京孚曼生物技術(shù)有限公司提供，比活性：275 FU/mg，批號(hào)：20110321，HPLC純度：83.66%，蛋白含量：24.4%(其余為NaCl)。保存方法：-20 ℃密封保存。②戊巴比妥鈉，規(guī)格：25 g，產(chǎn)品批號(hào)：F20030816，中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。③聚山梨酯80(吐溫80)，規(guī)格：500 g，批號(hào)：101212M，為上海申宇醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品。④大豆油(藥用級(jí))，規(guī)格：1 L，批號(hào)：09050101，由鐵嶺北亞藥用油有限公司提供。⑤紅四氮唑(TTC)，規(guī)格：10 g，批號(hào)：2010512，為上海中秦化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物的配法 ①50%FeCl3溶液的配制。36.5%的HCl 1 mL，加于9 mL雙蒸水得到1 mmol/L的HCl 10 mL。稱取FeCl35g，將FeCl3溶于1 mmol/L的10 mL HCl中，即得到50% FeCl3溶液。FeCl3·6H2O規(guī)格：500 g，批號(hào)：100325，為天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。36.5% HCl規(guī)格：500 mL，批號(hào)：100302，為白銀市良友化學(xué)試劑公司產(chǎn)品。②2%紅四氮唑(TTC)的配制。0.2 M pH 7.6的PBS緩沖液20 mL，加入TTC 0.4 g。TTC避光保存，臨用前配制。③0.3%戊巴比妥鈉的配制。稱取0.3 g的戊巴比妥鈉，溶于100 mL生理鹽水即可。④溶媒配制。取46.5 mL大豆油(藥用級(jí))與3.5 mL聚山梨酯80混勻即可，其中聚山梨酯80濃度為7.0%(V/V)。⑤納豆激酶油溶液配制。稱取145.6 mg納豆激酶凍干粉，加溶媒到10 mL后混勻，即得納豆激酶油溶液(4 000 FU/mL)。每只大鼠體質(zhì)量約400 g，每只給NK油溶液1 mL，含藥4 000 FU。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將24只wistar大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為兩組：模型對(duì)照組和NK組，每組各12只。2.3 給藥方案 模型對(duì)照組：給等容量溶媒(2.5 mL/kg)，同時(shí)給生理鹽水2.5 mL/kg。NK 組：10 000 U/kg(2.5 mL/kg，4 000 FU/mL，14.56 mg/mL)，同時(shí)給生理鹽水2.5 mL/kg。

2.4 模型制備方法[6]用0.3%戊巴比妥鈉按1 mL/100 g腹腔內(nèi)注射，麻醉后右側(cè)位固定，沿左眼外眥與外耳道連線的中點(diǎn)做一長(zhǎng)約2 cm的垂直切口，鈍性分離顴肌，咬去顴弓，撐開下頜關(guān)節(jié)，在顴弓根部前下方0.2 cm處用牙科鉆打薄骨質(zhì)，牙科探針挑去骨片，開一約4 mm×3 mm的骨窗，可見大腦中動(dòng)脈(MCA)沿嗅束垂直方向走行。取長(zhǎng)約3 mm浸于50% FeCl3溶液的1號(hào)線，帖于MCA中段(位于嗅束與大腦中靜脈之間)，每次帖線7.5 min，共四次，30 min。最后，生理鹽水沖洗創(chuàng)面，依次縫合組織、皮膚。

2.5 給藥方法 大鼠在MCA血栓形成術(shù)后立即經(jīng)十二指腸給藥一次，觀察藥物的治療作用。

2.6 神經(jīng)癥狀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]術(shù)后24 h按神經(jīng)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)神經(jīng)功能。神經(jīng)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：總分11分；尾部倒提時(shí)，患側(cè)上肢內(nèi)收，評(píng)為2分；肩外旋，評(píng)為2分；向?qū)?cè)推左(右)上肢，患側(cè)抵抗力下降，評(píng)為1～3分；將上肢置金屬網(wǎng)上，患側(cè)肢肌張力下降，評(píng)為1～3分；向患側(cè)旋轉(zhuǎn)，評(píng)為1分。

2.7 染色方法及腦梗死面積的計(jì)算 術(shù)后24 h將大鼠斷頭處死，取出大腦組織，置于-20 ℃冰箱15 min，待其凍硬后，用刀片將大腦沿冠狀面切成5片，置于2% TTC溶液中，37℃孵育30 min。取出腦片，按組織學(xué)順序鋪平后拍照，用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件計(jì)算梗死灶面積。

2.8 腦含水量的計(jì)算 拍照后分別稱取左、右側(cè)(患側(cè)和正常側(cè))大腦濕重，置于60 ℃溫箱72 h，烘干至恒重，稱干重計(jì)算兩側(cè)腦含水量。腦含水量(%)＝(濕重-干重)/濕重×100%。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 兩組大鼠腦片染色后圖片 治療后，NK組腦切片中下部白色梗死區(qū)域面積明顯小于模型對(duì)照組，見圖1～2。

圖1 模型對(duì)照組

圖2 NK組

3.2 NK對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠MCA血栓形成腦梗死面積的影響比較 與模型對(duì)照組相比，NK組的腦梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評(píng)分均明顯偏小，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。3.3 NK對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠MCA血栓形成術(shù)后腦含水量的影響比較 模型對(duì)照組和NK組的患側(cè)腦含水量均明顯高于正常側(cè)腦含水量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型對(duì)照組和NK組的患側(cè)腦含水量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表1 NK對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠MCA血栓形成腦梗死面積的影響比較(±s)

表1 NK對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠MCA血栓形成腦梗死面積的影響比較(±s)

?組別 例數(shù) 梗死面積(%) 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評(píng)分(分)模型對(duì)照組 12 6.67±1.02 7.17±1.40 NK組 12 5.45±0.78 5.92±1.01 t值 3.291 2.508 P值 0.002 0.010

表2 NK對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠MCA血栓形成術(shù)后腦含水量的影響比較(±s) 單位：%

表2 NK對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠MCA血栓形成術(shù)后腦含水量的影響比較(±s) 單位：%

組別 例數(shù) 患側(cè)腦含水量正常側(cè)腦含水量 t配對(duì)值 P值模型對(duì)照組 12 76.73±1.10 75.49±0.95 2.955 0.004 NK組 12 76.27±0.85 75.17±1.19 2.606 0.008 t值 1.146 0.728 P值 0.132 0.237

4 討論

近年來，血栓癥已逐漸成為死亡率居于首位的疾病，嚴(yán)重威脅中老年人群的身體健康[8]。應(yīng)用溶栓藥物來溶解血栓是治療血栓癥的主要手段。尿激酶、鏈激酶等屬于第一代溶栓藥物，對(duì)纖維蛋白無特異性的選擇作用，因此有半衰期短、出血傾向等缺點(diǎn)[9]。重組單鏈尿激酶、葡激酶、鏈激酶復(fù)合物、組織型纖溶酶原激活劑等屬于第二代溶栓藥物，其纖溶作用強(qiáng)于第一代藥物，然而仍然存在半衰期短、纖維蛋白特異性低、要求大劑量持續(xù)用藥、成本高等缺點(diǎn)[10]?；诖?，研發(fā)新型有效的溶栓藥物具有重要的臨床意義。NK是能夠直接溶解纖維蛋白的一種纖溶酶，近年來成為溶栓藥物關(guān)注的焦點(diǎn)[11]。NK于1987年由Sumi等日本學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)，通過納豆發(fā)酵所得，能夠明顯的溶解體外血栓，縮短優(yōu)球蛋白的溶解時(shí)間，有潛力成為新型的溶栓藥物[12]。本研究探討通過十二指腸給藥的途徑應(yīng)用NK對(duì)大鼠腦血栓的溶栓作用，以期為NK在臨床上應(yīng)用于抗血栓治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組相比，NK組的腦梗死面積和神經(jīng)癥狀24 h評(píng)分均明顯偏小，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示NK經(jīng)十二指腸給藥能夠明顯減小大鼠腦梗死面積，改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷。研究表明，NK從以下四個(gè)方面發(fā)揮溶栓作用：①溶解纖維蛋白，從而直接溶解血栓。②改善尿激酶原的空間結(jié)構(gòu)，從而激活尿激酶，發(fā)揮溶解血栓的作用。③刺激tPA的生成來溶解血栓。④降解纖維酶原激活劑的抑制劑來間接溶解血栓[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，機(jī)體有獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的消化產(chǎn)物-小肽，且其轉(zhuǎn)運(yùn)效率與小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PepT1)在腸道中的分布密切相關(guān)，而十二指腸中PepT1廣泛分布。研究認(rèn)為，十二指腸中的肽酶能夠?qū)K水解為9個(gè)小肽，從而有利于小腸全段對(duì)NK的充分吸收[15]。另外本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組和NK組的患側(cè)腦含水量均明顯高于正常側(cè)腦含水量，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；模型對(duì)照組和NK組的患側(cè)腦含水量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這可能是由于FeCl3和HCl的化學(xué)刺激導(dǎo)致兩組大鼠腦組織充血水腫甚至壞死，在術(shù)后24 h取腦時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩組均有大鼠患側(cè)腦組織缺損，這直接導(dǎo)致患側(cè)腦含水量數(shù)值較正常側(cè)高。此外在本實(shí)驗(yàn)實(shí)施的過程中發(fā)現(xiàn)，NK在含7.0%的吐溫80的大豆油中的溶解性不好，這會(huì)導(dǎo)致給藥過程中部分藥物丟失的風(fēng)險(xiǎn)，因此在后續(xù)的研究中需要探索新的溶媒來溶解NK，以提高給藥的準(zhǔn)確性。

綜上所述，NK經(jīng)十二指腸給藥能夠明顯減小大鼠腦梗死面積，改善神經(jīng)系統(tǒng)損傷。