胡婷婷，劉 淦，王文靜，李 磊，李夢(mèng)珠，楊進(jìn)孫，孫恩濤，陶香林

瘧疾是一種危害性極強(qiáng)的人獸共患性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2017年發(fā)生2.31億例瘧疾病例，造成41.6萬(wàn)人死亡，2018年發(fā)生2.28億例，造成40.5萬(wàn)人死亡，2018年疫情與2017年基本持平但情況仍不容樂(lè)觀[1]。各國(guó)之間頻繁的交流，增加了瘧疾向低風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)傳播及藥物抗性蟲(chóng)株于全球范圍內(nèi)傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[2]。瘧疾溯源有助于追溯藥物抗性蟲(chóng)株起源、明確瘧疾發(fā)源地及傳播路徑，及時(shí)制定應(yīng)對(duì)措施阻斷其傳播[3]。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)組合、微衛(wèi)星標(biāo)記、單倍型網(wǎng)絡(luò)是目前用于瘧疾溯源的常規(guī)分子標(biāo)記。Daniels等[4]曾選擇SNP作為分子標(biāo)記進(jìn)行溯源，但如何高通量獲取這些樣本的SNP仍需要測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法的優(yōu)化。微衛(wèi)星標(biāo)記的方法相對(duì)簡(jiǎn)便，但各實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)未完全統(tǒng)一，故在推廣應(yīng)用上存在限制性[5]。單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行溯源時(shí)，因頻繁的重組，使研究核基因組中單核苷酸多態(tài)性單倍型之間的祖先關(guān)系變得很復(fù)雜。綜上，以上方法均存在一定弊端，故選擇簡(jiǎn)便性、特異性的分子標(biāo)記物用于瘧原蟲(chóng)的溯源迫在眉睫。

隨著分子生物學(xué)研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)不同地域間的瘧原蟲(chóng)存在表型差異，且越來(lái)越多的研究選擇通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)研究瘧疾的地理起源[6-7]。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分子標(biāo)記物有mtDNA、SSU rRNA、18S rRNA等，而18S rRNA基因在確定瘧疾病原發(fā)源地時(shí)，準(zhǔn)確性、特異性相較其他溯源分子標(biāo)記物更有優(yōu)勢(shì)：18S rRNA極為保守，常作為靶基因應(yīng)用于瘧原蟲(chóng)基因檢測(cè)以及真核生物種屬之間的親緣關(guān)系比較。鑒于其進(jìn)化緩慢，18S rRNA基因通常也適用于古老生物的進(jìn)化分析。原蟲(chóng)的18S rRNA 基因在不同蟲(chóng)種間的變化比原核生物、真菌和動(dòng)植物間的差異大，可用來(lái)確定原蟲(chóng)之間的親緣關(guān)系[8]。18S rRNA基因在瘧原蟲(chóng)的各個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá)，據(jù)此設(shè)計(jì)瘧原蟲(chóng)種間特異引物相對(duì)合理，相對(duì)于瘧原蟲(chóng)其他標(biāo)記基因而言，更適合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[9-14]。Snounor、Stephaine等的相關(guān)研究證明瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因是追溯瘧原蟲(chóng)地理起源可靠的分子標(biāo)記物[15-16]。本研究構(gòu)建瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建立基于瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析的溯源方法，研究瘧原蟲(chóng)的地理起源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘧原蟲(chóng)基因序列 收集皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院2018年8月至2019年9月期間4例輸入性瘧疾患者的血樣，收集樣本經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)血樣采取提取、擴(kuò)增、測(cè)序等一系列操作獲得基因序列，其余地區(qū)基因數(shù)據(jù)從GenBank中搜集整理。

1.1.2 病歷資料 患者一：男，53歲，安徽省蕪湖市人，于 2019年9月從非洲回國(guó)，因頭暈頭痛、全身肌肉酸痛等癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊叨耗?，48歲，安徽省蕪湖市人，長(zhǎng)期于非洲工作，回國(guó)后因右上腹持續(xù)隱痛到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊呷耗校?3歲，安徽省蕪湖市人，于2019年1月從非洲回國(guó)，因發(fā)熱、頭痛等癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染?；颊咚模耗校?5歲，安徽省南陵縣人，在非洲尼日利亞居住4月有余，回國(guó)后因不慎摔倒出現(xiàn)大小便失禁、意識(shí)模糊癥狀到蕪湖市弋磯山醫(yī)院就診，確診為瘧疾感染。

1.1.3 主要試劑和儀器 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根)、磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)、T載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒(上海生工生物有限公司)、小型磁力架(上海生工)、離心機(jī)(Eppendorf 5430/R)、EPS-100核酸電泳儀Power Supply(上海天能 Tanon)、PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf)、、通用化學(xué)發(fā)光、熒光和可見(jiàn)光成像系統(tǒng) FluorChem FC3(美國(guó) Protein Simple公司)。

1.2 方 法

1.2.1 瘧原蟲(chóng)基因提取和擴(kuò)增 磁珠法基因組血液DNA抽提試劑盒(上海生工)瘧原蟲(chóng)基因組DNA提取、內(nèi)外引物瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因巢式PCR擴(kuò)增(瘧原蟲(chóng)屬特異性引物(外)rPLU5、rPLU6、惡性瘧原蟲(chóng)種特異性引物(內(nèi))rFAL1、rFAL2)。引物序列見(jiàn)表1。巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序和體系參照朱垚吉等[10]。

表1 瘧疾患者血樣18S rRNA基因擴(kuò)增引物序列

1.2.2 基因克隆測(cè)序分析 純化PCR產(chǎn)物、連接純化產(chǎn)物形成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐抗生素的固體培養(yǎng)皿篩選出陽(yáng)性質(zhì)粒克隆，采用雙脫氧鏈末端終止法(正反向)測(cè)序，于NCBI上進(jìn)行測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)分析。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 用于瘧疾溯源的18S rRNA基因參比序列從GenBank獲取，建樹(shù)所選的參比序列的地理來(lái)源包含亞洲、非洲、北美洲等地區(qū)。參比序列與血樣測(cè)序所得序列采用Clustal X、Edit Sequence軟件進(jìn)行序列分析、編輯及截取。用MEGA X對(duì)基因序列進(jìn)行同源性分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，進(jìn)化距離選項(xiàng)選擇Maximum Composite Likelihood，根據(jù)基因特征選擇鄰接法(N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap法進(jìn)行1 000次自舉檢驗(yàn)。惡性瘧原蟲(chóng)株來(lái)源及核苷酸序列見(jiàn)表2。

表2 惡性瘧原蟲(chóng)株來(lái)源及核苷酸序列

2 結(jié) 果

2.1 血樣標(biāo)本18S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 利用合成的引物擴(kuò)增4份血樣的18S rRNA基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度均為206 bp，經(jīng)測(cè)序和NCBI-BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示4例患者均是感染惡性瘧原蟲(chóng)。

2.2 測(cè)序標(biāo)本信息 對(duì)4份血樣PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并分析，結(jié)果顯示本研究采集的4份瘧疾患者血樣(序列號(hào)：MT991411-MT991414)均為非洲本地感染(見(jiàn)圖1)。

“*”表示本實(shí)驗(yàn)研究的4份血樣所得序列

2.3 基因變異特征 4份惡性瘧血樣18S rRNA基因雙向測(cè)序、剪接、拼接得到18S rRNA的靶序列，其余惡性瘧地理株序列從 GenBank 中獲得。用Clustal X(1.81)軟件對(duì)這些序列進(jìn)行排序比較及分析。惡性瘧18S rRNA靶序列長(zhǎng)度為206 bp，其中A占比31.4%，G占比16.4%，T占比40.4%，C占比11.8%；A+T占比71.8%，C+G占比28.2%，即堿基以A+T較多見(jiàn)，基因變異以顛換堿基數(shù)較多見(jiàn)，轉(zhuǎn)換與顛換率為0.6，主要發(fā)生在第三堿基位點(diǎn)，見(jiàn)表3。

表3 惡性瘧地理株18S rRNA基因堿基對(duì)轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)

2.4 基因同源性及遺傳距離 使用MEGA X軟件選擇Maximum Composite Likelihood法計(jì)算同源性及遺傳距離，結(jié)果如表4所示：來(lái)自非洲的惡性瘧原蟲(chóng)株與來(lái)自亞洲-2的惡性瘧原蟲(chóng)株同源性較近、遺傳距離較小；非洲與亞洲-1、非洲與北美洲的惡性瘧原蟲(chóng)株同源均性較遠(yuǎn)、遺傳距離均較大。

表4 非洲、亞洲、北美洲惡性瘧地理株18S rRNA基因序列的同源性及遺傳距離比較

2.5 18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) N-J法基于18S rRNA基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1。23個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)株大致分成3大分支：來(lái)自亞洲的部分惡性瘧原蟲(chóng)株(GenBank登錄號(hào)為：KT991230、KT991172、KT991186、GU816249)與來(lái)自非洲的惡性瘧原蟲(chóng)株關(guān)系密切，形成一大分支；其余亞洲的惡性瘧原蟲(chóng)株形成一大分支，且分布在進(jìn)化樹(shù)的外支；來(lái)自北美洲的惡性瘧原蟲(chóng)株形成另一分支。

在亞洲的惡性瘧原蟲(chóng)分離株中我們發(fā)現(xiàn)了2種拓?fù)漕?lèi)型，將其命名為亞洲-1(Asia1)、亞洲-2(Asia2)。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中我們發(fā)現(xiàn)，亞洲-2與來(lái)自非洲的惡性瘧原蟲(chóng)株聚為一支，推及其同源性及遺傳距離，可以看出亞洲-2與非洲的同源性近、遺傳距離?。幌喾吹?，亞洲-1與亞洲-2的同源性較遠(yuǎn)、遺傳距離大。

3 討 論

瘧疾是瘧原蟲(chóng)感染導(dǎo)致的傳染病，主要為按蚊叮咬傳播，少數(shù)為輸血傳播，存在高、低風(fēng)險(xiǎn)區(qū)交互傳播風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。瘧疾溯源對(duì)于追溯瘧疾發(fā)源地或者追溯藥物抗性蟲(chóng)株起源及傳播路徑的相關(guān)技術(shù)研究十分重要。

本研究基于瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析瘧原蟲(chóng)的地理起源，相對(duì)于Moritoshi Iwagami等通過(guò)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)分析瘧原蟲(chóng)的地理起源而言，操作簡(jiǎn)單[26-28]。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，所選4例惡性瘧原蟲(chóng)株與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)內(nèi)非洲的瘧原蟲(chóng)株遺傳關(guān)系較近，聚集在同一亞支，查詢(xún)患者病歷資料后發(fā)現(xiàn)實(shí)際輸入地與發(fā)育樹(shù)展示結(jié)果相符。亞洲的惡性瘧原蟲(chóng)分離株呈現(xiàn)出2種拓?fù)漕?lèi)型，說(shuō)明基因變異和遺傳距離可導(dǎo)致同一地區(qū)瘧原蟲(chóng)株的基因序列呈現(xiàn)出地理聚集差異和不同的空間聚類(lèi)特征，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中并不按照地理聚集[29-30]。北美洲的不同瘧原蟲(chóng)株按照地理來(lái)源分別聚集在相同的進(jìn)化亞支內(nèi)。以上證明，瘧原蟲(chóng)種群會(huì)根據(jù)地理位置分成不同的亞群，且人類(lèi)活動(dòng)會(huì)影響種群的分配，即根據(jù)該特性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)判斷瘧疾地理起源具有可行性[31]。以上結(jié)果表明18S rRNA基因是進(jìn)行瘧疾溯源研究的準(zhǔn)確性、特異性的分子標(biāo)記。未來(lái)可通過(guò)18S rRNA 的全基因測(cè)序進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，深入研究18S rRNA作為分子標(biāo)記來(lái)判定瘧疾是本地還是外地輸入性的實(shí)用性。系統(tǒng)發(fā)育分析能夠快速準(zhǔn)確地定位感染的地理來(lái)源，是確定輸入性疫情來(lái)源的有價(jià)值的公共衛(wèi)生工具[32-33]。

利益沖突：無(wú)