于祎飛，武亞敬*，李迎超，郭恒，任俊杰，張薇

（1.河北省林業(yè)和草原科學研究院，河北 石家莊 050061；2.中國林業(yè)科學研究院林研所，北京 100091；3.河北子水農業(yè)科技有限公司，河北 邢臺 054000；4.河北省紅崖山國有林場，河北 易縣 074200；5.邢臺市林木種苗管理站，河北 邢臺 054000）

我國是蘋果生產和銷售大國，2018 年我國蘋果種植面積約為207.17 萬hm2，產量達3 923.50 萬t，均居世界首位（FAO 統(tǒng)計數(shù)據(jù)）。隨著蘋果產業(yè)的飛速發(fā)展，生產上對苗木品質的要求越來越高，繁育優(yōu)質幼苗越來越多地受到人們的關注[1～7]。在果樹生產中，苗木質量是果樹健壯栽培的基礎，直接影響著樹體的生長發(fā)育以及果實產量和品質。現(xiàn)階段我國蘋果品種的苗木繁育以嫁接繁殖為主，育苗受季節(jié)限制，苗木繁育速度慢，容易感染病毒，而目前國內的蘋果主栽品種及砧木普遍帶有病毒，帶毒率一般為60%～80%[3]。紅國光蘋果是河北省林業(yè)和草原科學研究院通過芽變選種由國光蘋果選育出的紅色芽變新品種，經蘋果銹果病類病毒PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)其母本帶毒率達17.5%[8]。

蘋果組織培養(yǎng)是采用無菌培養(yǎng)技術，將來自優(yōu)良植物的莖尖、腋芽、葉片、鱗片、塊根和球莖等器官以及它們的組織切片進行離體培養(yǎng)，使之在短期內獲得大量遺傳性一致個體的方法。由于離體技術處理嚴格，所以很容易脫除一些細菌病原及病毒，是復壯品種的有效措施。容器育苗是當今世界林木育苗的一項先進技術，在生產上已得到廣泛應用[9～14]，與普通裸根苗相比，具有節(jié)約種子、苗木出圃率高，易于搬運規(guī)格和質量易控制，造林成活率高等優(yōu)點[15，16]。但是，目前我國果樹育苗仍以嫁接、扦插、裸根生產方式為主，與世界先進水平相比存在較大差距。

蘋果組織培養(yǎng)快繁的主要過程包括初代培養(yǎng)（芽誘導）、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、栽前煉苗和栽后管理等[17，18]。為提高紅國光蘋果的擴繁效率，實現(xiàn)良種壯苗，根據(jù)其組織培養(yǎng)的生長特性，分別在組培擴繁各個階段設置添加不同特異性物質的培養(yǎng)基處理。通過對紅國光蘋果組織培養(yǎng)中營養(yǎng)物質和生長素等添加劑的篩選，以期形成一套完整、高效的蘋果組培快繁生產技術，為組培快繁技術應用于蘋果無病毒苗木繁育和商業(yè)化生產提供技術支持，促進蘋果產業(yè)的健康、快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗蘋果品種為紅光1 號。

1.2 試驗方法

2018 年果樹萌芽前（3 月15 日），在張家口市懷來縣紅國光蘋果種質資源圃選擇生長健壯、無病蟲害的紅國光蘋果樹，采集1 a 生枝條（長度＞1 m）100根，裝入冰盒冷藏，迅速帶回試驗室，進行水培培養(yǎng)、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、栽前煉苗和栽后管理。為確定適宜紅國光蘋果組培快繁方法，針對每個環(huán)節(jié)進行了培養(yǎng)基配方的篩選研究。

1.2.1 水培培養(yǎng)時水培營養(yǎng)液種類的篩選 將枝條置于25 ℃溫室內進行水培，試驗營養(yǎng)液種類為富里酸原液（fulvic acid，F(xiàn)A）10 000 倍水溶液（P1處理），每5～7 d 換1 次；以清水處理為對照（CK）。調查枝條發(fā)芽所需時間和換水次數(shù)。

1.2.2 初代培養(yǎng)時初代培養(yǎng)基成分的篩選 當水培的枝條抽生出2～3 片葉時截取莖段，依次用純凈水沖洗5 遍、酒精擦拭3 遍、蒸餾水沖洗3 遍；取嫩芽接種到初代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，試驗初代培養(yǎng)基成分設MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L（P）1、WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L（P）2和White+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L（P）33 個處理，每瓶接3 個，每處理11 瓶，3 次重復；然后，在光照強度2 000～2 500 lx、光照時間14h（白天）/10 h（夜間）、溫度（25±2）℃條件下進行培養(yǎng)。30 d 后，調查污染率、褐化率和成活率。

1.2.3 繼代培養(yǎng)時繼代培養(yǎng)基成分的篩選 將獲得的無菌外植體接種到繼代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，試驗繼代培養(yǎng)基成分設MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L（P）1、 WPM+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L （P）2、White+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L （P）3、MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.03 mg/L （P4） 和 MS+6-BA 1.2 mg/L+NAA 0.07 mg/L（P5） 5 個處理，每瓶接 3 個，每處理11瓶，3 次重復；然后，在光照強度2 200～2 600 lx、光照時間14 h（白天）/10 h（夜間）、溫度（25±2）℃條件下進行培養(yǎng)。45d 后，調查擴繁株數(shù)，并計算擴繁系數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)時生根培養(yǎng)基成分的篩選 選擇繼代培養(yǎng)獲得的生長健壯（顏色嫩綠、植株粗度達到0.2 cm）、高度＞2 cm 的植株，取生長時間為28～32 d的芽，接種于生根培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，試驗生根培養(yǎng)基成分設1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂4.5 g/L（P1）、1/2MS+IAA 0.8 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂4.5 g/L（P2）和1/2MS+IAA 1.2 mg/L+IBA 0.8 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂4.5 g/L（P3）3 個處理，每瓶接3 個，每處理33 瓶，3 次重復；然后，在光照強度2 300～2 700 lx、光照時間14 h（白天）/10 h（夜間）、溫度（25±2）℃條件下進行培養(yǎng)。40 d 后，調查生根情況，并計算生根率。

1.2.5 栽前煉苗時浸泡藥劑種類的篩選 當組培苗平均生根3 條以上、根長度達到2 cm 后，移到室外遮陽煉苗3 d；然后將組培瓶口打開，在自然光下開瓶煉苗3 d 后將生根苗從培養(yǎng)基中取出，分別采用海藻素2 000 倍液+多菌靈2 000 倍液（P1）、海藻素2 000倍液（P2）和多菌靈2 000 倍液（P3）浸泡 5 min，并將根部多余的培養(yǎng)基清洗干凈，然后移栽到輕基質（泥炭、珍珠巖、蛭石按體積比4 ∶3 ∶3 混合而成，下同）網袋容器中。40 d 后，調查生根情況，并計算生根率和煉苗成活率。

1.2.6 移栽煉苗時噴灌藥劑種類的篩選 將清洗后的植株移栽到輕基質網袋容器中，在遮陽網下進行管理：第1 周采用藥劑溶液進行噴灌，試驗藥劑種類設多菌靈1 000 倍液+阿司匹林50 mg/L 溶液（P1）、多菌靈1 000 倍液 （P2）和阿司匹林 50 mg/L 溶液 （P3） 3個處理；第2 周每天用清水噴灌1 次，保持基質濕潤透氣。待生根苗抽生出新芽后移出遮陽網。煉苗期溫度控制在20～25 ℃、濕度為75%～85%。移栽10 d 后，調查生根情況，并計算生根率和移栽成活率。

2 結果與分析

2.1 水培營養(yǎng)液種類的篩選

P1處理的枝條發(fā)芽所需時間為13～15 d，中間需換營養(yǎng)液2～3 次，較常規(guī)方法提早發(fā)芽3～5 d、減少換水6～8 次（表1）。表明用富里酸原液的10 000 倍水溶液進行水培效果優(yōu)于清水培養(yǎng)，不僅可促進蘋果枝條提早發(fā)芽，還可有效減少換水次數(shù)，降低工作量。

表1 不同營養(yǎng)液水培枝條發(fā)芽所需的時間和換水次數(shù)Table 1 The sprouting time and water changing times of hydroponics branches with different nutrient solution

2.2 初代培養(yǎng)基成分的篩選

試驗處理的嫩芽污染率為5.01%～8.08%，指標值順序為 P2＜P1＜P3，其中 P1與 P3處理差異不顯著，但二者均與P2處理差異達到了顯著水平；褐化率為8.08%～45.45%，指標值順序為P1＜P2＜P3，不同處理間差異均達到了顯著水平；幼苗成活率為46.47%～84.85%，指標值順序為P1＞P2＞P3，不同處理間差異均達到了顯著水平（表2）。綜合分析污染率、褐化率和成活率3 項指標，認為P1處理效果最好，即紅國光蘋果組培苗初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基成分為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L。

表2 不同成分初代培養(yǎng)基的嫩芽成活情況Table 2 The survival of buds in primary culture medium with different components （%）

2.3 繼代培養(yǎng)基成分的篩選

試驗處理的外植體擴繁系數(shù)為3.33～4.67，其中P1處理的指標值最大、P5處理次之，二者差異不顯著，但均顯著＞其他3 個處理（表3）。表明P1處理效果最好，即紅國光蘋果組培苗繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基成分為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

表3 不同成分繼代培養(yǎng)基的擴繁系數(shù)Table 3 The propagation coefficient of subculture medium with different components

2.4 生根培養(yǎng)基成分的篩選

試驗處理的生根率為72.73～90.90%，指標值順序為P1＞P2＞P3，不同處理間差異均達到了顯著水平（表4）。表明P1處理效果最好，即紅國光蘋果組培苗生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基成分為1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L，在MS 培養(yǎng)基的基礎上添加適量生長素類物質可明顯促進紅國光蘋果組培苗生根。

表4 不同成分生根培養(yǎng)基的生根率Table 4 The rooting rate of rooting medium with different components （%）

2.5 栽前煉苗時浸泡藥劑種類的篩選

試驗處理的生根率為68.69%～90.90%，煉苗成活率為 72.74%～92.92%，指標值順序均為 P1＞P2＞P3，不同處理間差異均達到了顯著水平（表5）。表明P1處理效果最好，即栽前煉苗時增加用海藻素2 000倍液與多菌靈2 000 倍液混合液浸泡并將根部多余培養(yǎng)基清洗干凈的環(huán)節(jié)，可明顯促進組培苗生根，有效提高煉苗成活率。

表5 不同藥劑處理后組培苗的生根率和煉苗成活率Table 5 The rooting and survival rate of tissue culture seedlings treated with different chemicals （%）

2.6 移栽后噴灌藥劑種類的篩選

試驗處理的生根率為75.86%～91.92%，煉苗成活率為 76.74%～93.94%，指標值順序均為 P1＞P3＞P2，不同處理間差異均達到了顯著水平；移栽成活率為75.86%～92.92%，指標值順序均為 P1＞P2＞P3，不同處理間差異均達到了顯著水平（表6）。表明P1處理效果最好，即組培苗移栽后1 周內用多菌靈1 000 倍液與阿司匹林50 mg/L 的混合液進行噴灌，可明顯促進成活，有效提高移栽成活率。

表6 不同添加物對生根和煉苗成活影響Table 6 The effect of different additives on rooting and seedling survival （%）

3 結論與討論

3.1 討論

本研究中采用水培煉苗的方法，將組培苗閉瓶培養(yǎng)在富里酸原液的水培營養(yǎng)液，克服了常規(guī)煉苗過程中去封口膜后培養(yǎng)基干裂、霉菌過多繁殖的問題。

初代培養(yǎng)MS 培養(yǎng)基可以提供組織生長所需的礦質營養(yǎng)，在生長素類物質含量相同的條件下，該培養(yǎng)基較WPM 和White 培養(yǎng)基顯著提高擴繁系數(shù)。繼代培養(yǎng)過程中，在MS 培養(yǎng)基的基礎上添加低濃度的生長調節(jié)劑有利于擴繁，但濃度過高或過低均不利于組培苗的培養(yǎng)。

不定根誘導是組培過程中關鍵的一步[19]，在碳源和礦質元素一定量的基礎上添加生長素類物質有利于根系的形成。IAA 和IBA 不同添加量試驗結果顯示，添加IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L 時最有利于根系發(fā)育，濃度過高和過低都不利于發(fā)根。說明在碳源和礦質元素充足的條件下，適當添加生長素類物質有利于不定根的產生。

移栽苗基質的成分和粒徑會影響到苗木的生長，不同基質含量影響基質的各項物理指標，進而影響到苗木的各項生理指標[20～24]，基質各項理化性狀決定了苗木的品質。本研究條件下結果顯示，選用泥炭、珍珠巖、蛭石按體積比4 ∶3 ∶3 混合而成的培養(yǎng)基，有利于組培苗的生根和成活。該配方基質能夠在較短的時間內實現(xiàn)蘋果新品種組培苗木的快速繁殖，保留了品種的優(yōu)良特性，有利于該品種的保存。用多菌靈1 000 倍液與阿司匹林50 mg/L 溶液的混合液噴灌，可以起到很好的殺菌作用，既能防止植株感染，促進苗木快速生根，提高成活率，又能提高苗木的抗逆性。

3.2 結論

1 a 生蘋果枝條進行水培時，營養(yǎng)液選用富里酸原液的10 000 倍水溶液效果較好。一方面，可高效提供營養(yǎng)成分，促進蘋果枝條快速生長，較常規(guī)方法提早發(fā)芽3～5 d，節(jié)省組培時間；另一方面，可有效減少換水次數(shù)，降低工作量。

采用成分為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L 的培養(yǎng)基進行初代培養(yǎng)，成活率為84.85%，有利于紅國光組培苗的建立。

采用成分為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L 的培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)后，擴繁系數(shù)達4.67。采用成分為 1/2MS+IAA 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L+蔗糖 20 g/L+瓊脂4.5 g/L 的培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)，生根率達90.90%。

栽前煉苗時采用海藻素2 000 倍液+多菌靈2 000倍液充分混合后浸泡5 min，并將根部多余的培養(yǎng)基清洗干凈，不僅可以促進組培苗快速生根，還可以起到殺菌滅菌的作用，提高煉苗成活率。

移栽苗的管理方式為將生根苗在遮陽網下進行管理。第1 周采用多菌靈1 000 倍液+阿司匹林50 mg/L溶液混合后進行噴灌，可以起到很好的殺菌作用，促使苗木快速生根；第2 周每天用清水噴灌1 次，保持基質濕潤透氣。

本研究以紅國光蘋果的1 a 生枝條為試材，經過水培培養(yǎng)、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、栽前煉苗、栽后管理，得到優(yōu)質苗木，確定適合水培的添加物質，篩選出MS 培養(yǎng)基和適宜的的生長素類物質及含量，明確栽培基質的最佳含量比例以及栽前煉苗的海藻素和阿司匹林含量，形成了一套完整的組織培養(yǎng)技術，可為蘋果無病毒苗木繁育和商業(yè)化生產提供技術支持。