張 瑾，康 樂，李秀敏，苗明三

（1.河南中醫(yī)藥大學 藥學院，鄭州 450000；2.紐約醫(yī)學院 微生物和免疫學科，紐約 10595）

急性粒 單核細胞白血病是一種由于粒細胞和單核細胞兩系同時發(fā)生惡性增生的急性白血病。在臨床中約占急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）發(fā)病人數(shù)的15%［1］，具有緩解率低、易復(fù)發(fā)的特點［2］。AML在中醫(yī)學中屬于“熱勞”“溫病”“血證”“痰核”“瘰疬”“癥瘕”“積聚”“虛勞”等范疇，在治療中應(yīng)以清熱解毒為根本［3］。

四鮮湯是由鮮生地、鮮小薊、鮮蒲公英、鮮白茅根4味藥組成，具有養(yǎng)陰清熱、涼血解毒、寧絡(luò)止血之功。在服用時，將鮮藥洗凈切碎，直接取汁飲用，可以治療由陰虛內(nèi)熱引起的各種血液病和出血性疾?。?］。

本實驗主要以四鮮湯鮮藥汁為研究對象，采用急性粒單核白血病細胞（WEHI-3細胞）制備AML小鼠模型，觀察四鮮湯鮮藥汁對AML動物模型的影響，并探討其抑制作用，為四鮮湯鮮藥應(yīng)用于治療白血病提供了理論及實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性BALB／c小鼠，18～21 g，購自山東省濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190003，動物合格證號：1107261911002008，實驗前小鼠適應(yīng)環(huán)境至少1周。將小鼠（每組12只）置于塑料籠中，12 h光－照循環(huán)（23℃，（55±5）%濕度）下，自由飲水。所有涉及動物的實驗程序均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（豫）2015－0005。

1.2 實驗藥品

四鮮湯：鮮地黃150 g，鮮蒲公英、鮮小薊、鮮白茅根各300 g；將以上4味藥稱重，除去雜質(zhì)，洗凈，將其切成3～5 mm的片或段，用榨汁機榨取鮮藥汁后再次稱重，計算鮮藥比例折算用量，得四鮮湯鮮藥汁（本實驗所采用的鮮地黃1 g相當于鮮地黃汁1.14 mL；鮮蒲公英1 g相當于鮮蒲公英汁1.83 mL；鮮小薊1 g相當于鮮小薊汁1.60 mL；鮮白茅根1 g相當于鮮白茅根汁2.98 mL），即鮮地黃汁171.06 mL、鮮蒲公英汁547.68 mL、鮮小薊汁481 mL、鮮白茅根汁895.8 mL。消癌平片（陽性對照藥），購于長春銀諾克藥業(yè)有限公司，批號：20190801。

1.3 實驗試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司，批號：20191011；Lonsera南美胎牛血清，上海雙洳（思洳）生物科技有限公司，批號：OH12343；青鏈霉素混合液，北京索萊寶科技有限公司，批號：20190712；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，北京索萊寶科技有限公司，批號：20190506；Hyclone磷酸鹽緩沖溶液（PBS）批號：AE29042298；FITC anti-mouse CD3抗體，美國BioLegend公司，批號：B291431；PEanti-mouse CD19抗體，美國BioLegend公司，批號：B288652；PE anti-mouse／human CD11b抗體，美國BioLegend公司，批號：B294977；FITC anti-mouseCD107b（Mac-3），美國BD BIOSCIENCES PHARMINGEN公司，批號：9050953；小鼠白細胞介素2（IL-2）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：E20200501A；小鼠白細胞介素3（IL-3）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：E20200501；小鼠干擾素γ（IFN-γ）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：E20200501；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒，蘇州卡爾文有限公司，批號：2411639601。

BIO-RAD680酶標儀（美國BIO-RAD公司）；Forma 371 CO2細胞培養(yǎng)箱，美國ThermoFisher Scientific公司；CytoFLEX流式細胞儀，美國Beckman公司；Coutstar細胞分析儀，上海睿鈺生物科技有限公司；BX63-CellSens全電動智能顯微鏡，日本Olympus公司；H2050R臺式高速大容量冷凍離心機（湖南湘儀開發(fā)有限公司）；DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海－恒科學儀器有限公司）；Wellwash Versa雙排全自動洗板機，美國ThermoFisher Scientific公司。

1.4 白血病細胞株和細胞培養(yǎng)

WEHI-3小鼠白血病細胞，購于Otwo Biotech（ShenZhen），貨號：HTX2665。細胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在5%飽和濕度的無菌恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天傳代1次。

2 實驗過程

1）模型制備

體外培養(yǎng)WEHI-3細胞，待細胞進入對數(shù)生長期后進行擴增，收集細胞后以PBS重懸并計數(shù)，調(diào)整細胞密度至5×106個／mL，取60只BALB／c小鼠，雄性，SPF級，8～10周齡，體重20～22 g，每只小鼠腹腔注射0.2 mL細胞懸液，即每只小鼠接種1×106個WEHI-3細胞。

2）給藥方法

隨機分為5組，即：模型組（WEHI-3）、陽性對照組（消癌平，2.25 g／kg，0.1 mL／10 g）、四鮮湯汁低劑量組（24.5 g／kg，相當于臨床劑量的7.5倍，0.4 mL／10g）、四鮮湯汁中劑量組（49 g／kg，相當于臨床劑量的15倍，0.4 mL／10g）、四鮮湯汁高劑量組（98 g／kg，相當于臨床劑量的30倍，0.4 mL／10 g），每組12只，先接種白血病細胞，接種10 d后各組灌胃相應(yīng)藥物。另設(shè)12只空白對照組，同模型組每日給予等量溶媒，0.2 mL／只，每日1次，連續(xù)14 d。

3 指標檢測

1）表觀指標觀察

給藥期間每日觀察各組小鼠的一般精神狀態(tài)、進食情況、體重等方面的變化。

2）細胞因子檢測

末次給藥1 h后，小鼠眼眶取血，4℃離心（3 500 rpm）10 min，收集上清，用細胞因子酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測樣本中的白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-3（Interleukin-3，IL-3）、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量。具體方法按試劑盒說明進行。450 nm波長處讀取光密度值。各細胞因子濃度參照已知濃度標準品繪制的標準曲線判定。

3）白細胞表面標記物檢測

末次給藥后，對所有小鼠進行稱重，眼眶抗凝取血，與肝素混勻后置于室溫，取抗凝全血100 μL，每管加入室溫紅細胞裂解液4 mL，充分混勻，室溫靜置3 min。1 000 rpm離心5 min，棄上清。用PBS洗滌2次，每次4 mL，1 000 rpm離心5 min，棄上清。用100μL PBS重懸細胞，加入熒光標記抗體，混勻，4℃避光孵育40 min。每組分別設(shè)置空白和單標。用PBS洗滌2次，每次4 mL，1 000 rpm離心5 min，棄上清。用200μL PBS重懸細胞，4℃避光放置，2 h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞標志物百分率。

4）脾臟病理觀察

各組小鼠處死后，取出小鼠的脾臟，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后進行H＆E染色，在光鏡下觀察其病理學變化。

5）統(tǒng)計學處理

用SPSS21.0 for windows對數(shù)據(jù)加以分析，實驗結(jié)果以平均值±標準差（±s）的形式表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差不齊者用Games-Howell法，齊者用LSD法，等級資料采用Ridit檢驗。

4 結(jié)果

4.1 各組小鼠體質(zhì)量情況

空白組小鼠體重平穩(wěn)增長，毛發(fā)正常，精神良好，行為活躍。與空白組比，模型組小鼠隨著造模時間增加，體重有明顯增加的趨勢（P＜0.05或P＜0.01），可能是由于腹腔形成腫瘤和腹水的原因：表現(xiàn)為弓背蜷縮、聚團、皮毛枯萎、精神萎靡、活動減少等體征。與模型組比較，各給藥組小鼠弓背蜷縮、聚團、皮毛枯萎、精神萎靡、活動減少等體征均有改善；給藥第5 d，與模型組相比，四鮮湯汁中劑量組小鼠體重明顯下降（P＜0.05）；給藥第9 d，與模型組相比，消癌平組、四鮮湯汁中劑量組小鼠體重明顯下降（P＜0.05）；給藥第14 d，與模型組相比較，四鮮湯汁中劑量組小鼠體重顯著下降（P＜0.01），消癌平組小鼠體重明顯下降（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量情況折線圖（±s，n＝12）

4.2 各組小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-α的含量

圖2為各組小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNFα的含量。

圖2 各組小鼠血清IL-2、IL-3、TNF-α和IFN-γ的含量（±s，n＝12）示意圖與空白組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05，；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

由圖2可知：與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-2顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，消癌平和四鮮湯汁各劑量可顯著升高小鼠血清中IL-2的水平（P＜0.01）。與空白組相比，模型組小鼠血清中IL-3顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，四鮮湯汁低劑量組可明顯升高小鼠血清中IL-3水平（P＜0.05），四鮮湯汁各劑量均能夠不同程度升高小鼠血清中IL-3的水平。與空白組相比，模型組小鼠血清中TNF-α有所降低；與模型組相比，四鮮湯汁低、中劑量組可顯著升高小鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.01）；四鮮湯汁高劑量組也可明顯升高小鼠血清中TNF-α的水平（P＜0.05）。與空白組相比，模型組小鼠血清中IFN-γ顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，四鮮湯汁中、高劑量可顯著升高小鼠血清中IFN-γ的水平（P＜0.01）；四鮮湯汁低劑量組也可明顯升高小鼠血清中IFN-γ的水平（P＜0.05）。

4.3 各組小鼠白細胞表面標志水平

本研究通過CD11b分子、Mac-3分子、CD3和CD19檢測各組小鼠白細胞表面標志水平（圖3）。模型組小鼠的CD11b水平明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，消癌平組和四鮮湯汁各劑量組的CD11b均有下降趨勢，其中四鮮湯汁低劑量較之模型組明顯下降（P＜0.05），四鮮湯汁中、高劑量的CD11b水平顯著下降（P＜0.01）。模型組小鼠Mac-3水平顯著升高（P＜0.01），四鮮湯汁低劑量的Mac-3水平較之模型組明顯下降（P＜0.05），消癌平組、四鮮湯汁中、高劑量的Mac-3水平顯著下降（P＜0.01）。此外，與模型組相比，消癌平組和四鮮湯汁各給藥組小鼠的CD3和CD19的水平均比模型組升高，與空白組相比，模型組小鼠CD3的比率均顯著降低（P＜0.01），其中消癌平組和四鮮湯汁低劑量的CD3比率明顯升高（P＜0.05），四鮮湯汁中、高劑量組則顯著升高（P＜0.01）。模型組小鼠CD19的比率顯著降低（P＜0.01）。四鮮湯汁低劑量組的CD19比率明顯升高（P＜0.05），消癌平組、四鮮湯汁中、高劑量組的CD19也有升高趨勢。

圖3 白細胞表面分子標志（±s，n＝12）直方圖與空白組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05，；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

4.4 脾臟病檢

圖4為各組小鼠脾臟病理變化情況，由圖4可知，空白組小鼠脾臟正常，結(jié)構(gòu)完整，紅白髓間界限清楚，脾小體結(jié)構(gòu)清晰。模型組小鼠脾臟紅白髓間界限模糊，脾臟的淋巴細胞減少。消癌平組脾臟的淋巴細胞較模型組多。四鮮湯鮮藥汁的低、中、高劑量組脾臟正常，脾小體結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)完整，淋巴細胞較模型組多，提示細胞的免疫功能增強。

圖4 各組小鼠脾臟病理圖

5 結(jié)果與討論

急性髓系白血病是最常見的急性白血病，多數(shù)病例發(fā)病迅猛，預(yù)后較差。目前主要治療方案為化療和造血干細胞移植，但經(jīng)常會出現(xiàn)化療效果不理想、毒副作用較大、容易復(fù)發(fā)等情況［5］。目前AML的發(fā)病機制尚未完全清楚，現(xiàn)有研究表明其誘因有物理、化學、生物及遺傳因素等。免疫功能異常也會增加發(fā)生AML的風險［6－7］。

鮮藥具有活性成分含量高、療效好的特點［8］。在臨床上最常見的應(yīng)用鮮藥的方法是自然汁服用，這種方式能保持藥物天然的活性成分［9］，適用于急危重癥、外感熱病、邪熱熾盛或化火傷陰等病癥的治療。現(xiàn)代中醫(yī)學認為急性髓系白血病是由于正氣虛損與邪毒內(nèi)侵并舉，正邪相爭，久病則虛，毒在骨髓、氣血津液傳變，致使臟腑氣血功能受損失調(diào)，氣血虧耗，內(nèi)虛為本，病情反復(fù)。治療原則應(yīng)以本虛標實為根本，或邪盛正虛、正虛邪伏、正勝邪退［10］。四鮮湯中鮮生地在生理活性上對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等有明顯的作用，并具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎等藥理作用［11］；鮮小薊的藥理作用包括止血凝血、抗菌抗炎、抗癌等［12］；鮮蒲公英在抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗病毒、抗氧化、胃腸保護、利尿等方面有顯著的藥理活性［13］；鮮白茅根具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、止血、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等藥理作用［14］。中醫(yī)藥治療急性白血病具有一定的特色和優(yōu)勢，目前已有研究證實四鮮湯治療急性白血病具有良好療效［15］。

本實驗結(jié)果表明：四鮮湯鮮藥汁可改善模型小鼠的活動情況，不同程度的升高小鼠血清IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-α的含量，其中IL-2屬于Th1細胞因子，具有增強Th1免疫反應(yīng)的能力，介導(dǎo)激活CD8＋CTL細胞，產(chǎn)生致炎性細胞因子，增強NK細胞活性，從而發(fā)揮抗細菌、抗病毒和抗腫瘤的作用［16－17］；IL-3由受到抗原刺激而被活化的輔助T細胞產(chǎn)生，是反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥性細胞因子，具有造血和免疫調(diào)節(jié)的作用［18－19］；IFN-γ具有較強的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)功能，治療后的小鼠IFN-γ升高說明了四鮮湯鮮藥汁可以提高免疫功能，激活機體的免疫狀態(tài)［20－21］；TNF-α具有抗腫瘤作用，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，與機體的炎癥、免疫反應(yīng)有密切關(guān)系［22－23］，證明了四鮮湯鮮藥汁可以調(diào)節(jié)免疫功能，刺激細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。四鮮湯鮮藥汁治療組降低了CD11b和Mac-3的水平，升高CD3和CD19的水平。CD11b在正常情況下，主要在成熟單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞上表達，其主要功能是促進炎癥的發(fā)生和發(fā)展，促進吞噬細胞的吞噬功能等，在機體的抗感染免疫中發(fā)揮重要作用［24］。CD3是成熟T淋巴細胞，表示人體細胞免疫功能狀態(tài)，其水平升高表示了機體識別和殺傷腫瘤細胞的能力上升［25］。CD19參與B細胞的增殖、分化、活化及抗體產(chǎn)生，可以促進BCR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［26］，這些結(jié)果證明了四鮮湯鮮藥汁提高了T、B細胞的增殖能力，從而抑制了單核細胞和巨噬細胞的增殖［27］，增強了機體的抗腫瘤能力。并且四鮮湯鮮藥汁能明顯改善脾臟的病理變化，并未造成機體的肝損傷。

本實驗證明了四鮮湯鮮藥汁對AML有較好的治療作用，為鮮藥在現(xiàn)代應(yīng)用中的進一步發(fā)展提供了實驗基礎(chǔ)。