趙院院，曹利華，李秀敏，苗明三

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，鄭州 450046；2.紐約醫(yī)學(xué)院 微生物和免疫學(xué)科，紐約 10595）

升降散源于《傷寒溫疫條辨》，是治療瘟疫十五方之首方，該方由白僵蠶、蟬蛻、姜黃和大黃4種藥物組成。其“一升一降，內(nèi)外通和，而雜氣之流毒頓消矣！”國醫(yī)大師李士懋認(rèn)為，凡存在氣機(jī)壅塞不通時，均可用升降散來調(diào)理氣機(jī)，透邪外出［1］。蔣建勝［2］通過臨床實踐發(fā)現(xiàn)升降散對小兒病毒性肺炎具有良好的治療作用，可以明顯改善小兒咳嗽、發(fā)熱等癥狀。有研究證實升降散可抗流感病毒和提高機(jī)體的免疫力，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)可明顯減輕小鼠的肺部病變程度，通過臨床對比西藥發(fā)現(xiàn)，升降散降溫效果平穩(wěn)顯著［3］。

新型冠狀病毒（COVID-19）［4］是一種呈圓形或橢圓形，其直徑在60～140 nm的β屬的冠狀病毒，傳染性強(qiáng)，可通過多種途徑傳播，免疫力低下和有基礎(chǔ)病的人群更易感染，患者的癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、胸悶氣短、干咳、渾身乏力酸痛等癥狀，重癥患者表現(xiàn)出急性呼吸窘迫癥狀、休克、凝血功能障礙甚至導(dǎo)致死亡［5］。中醫(yī)藥在“非典”時期就發(fā)揮了獨特的作用，在本次抗擊疫情中也發(fā)揮了獨特的療效。唐璇等［6］通過檢索、分析新冠肺炎疫情爆發(fā)以來使用COVID-19診療方案或中醫(yī)藥防治方案的文件后發(fā)現(xiàn)，升降散作為經(jīng)典名方位居前列。但是升降散是如何發(fā)揮治療COVID-19的作用，目前尚不清楚。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析研究升降散是如何發(fā)揮對COVID-19的潛在療效，探討其作用機(jī)制，可為治療COVID-19提供參考。

1 材料

中藥成分和靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）；中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional chinese medicine，BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）。疾病有關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫（gene cards，GC https://www.genecards.org/）。蛋白互作數(shù)據(jù)庫：檢索相互作用基因的搜索工具（search tool for the retrieval of interacting genes，STRING，https://string-db.org/）。生信在線分析平臺：DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）。網(wǎng)絡(luò)分析及作圖軟件：Cytoscape 3.7.2；Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），R語言軟件包。

2 方法

1）升降散活性成分及對應(yīng)靶點的篩選

以升降散的組方中藥“大黃”“姜黃”“僵蠶”“蟬蛻”為檢索詞，以藥代動力學(xué)有關(guān)參數(shù)為設(shè)定依據(jù)，口服生物利用度值設(shè)為（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性設(shè)為（drug-likeness，DL）≥0.18從TCMSP［7］篩選升降散的活性成分及相關(guān)靶點；同時借助BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫［8］，將條件設(shè)置為得分（score）大于20，P值小于0.05，得到升降散活性成分及相關(guān)靶點。合并以上數(shù)據(jù)庫得到活性成分及對應(yīng)靶點。最后通過Unipro和NCBI Gene數(shù)據(jù)庫將靶蛋白轉(zhuǎn)換為官方名稱并進(jìn)一步校正。

2）COVID-19靶點的預(yù)測

以“novel coronavirus pneumonia”為檢索詞，限定條件為“Homo sapiens”，通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲取COVID-19相關(guān)靶點。

3）升降散治療COVID-19的潛在靶點

借助Venny2.1.0在線繪圖軟件，將升降散中活性成分的有關(guān)靶點和有關(guān)COVID-19的靶點進(jìn)行交集，得到升降散治療COVID-19的潛在靶點。

4）成分－靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將包含活性成分、活性成分作用COVID-19的潛在靶點、相互作用關(guān)系屬性的文件，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，構(gòu)建“升降散－活性成分-COVID-19靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

5）蛋白－蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選

將升降散潛在治療COVID-19的靶點導(dǎo)到STRING數(shù)據(jù)庫［9］，把物種設(shè)定為“Homo sapiens”，交互作用評分大于0.7并隱藏?zé)o相互作用的靶點，下載.tsv格式的PPI文件。將該文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中，通過Neywork Analyze進(jìn)行拓?fù)浞治觯凑铡癉egree”值大小篩選關(guān)鍵靶點。

6）GO富集分析與KEGG通路分析

通過DAVID網(wǎng)站［10］對關(guān)鍵靶點蛋白進(jìn)行Go富集和KEGG通路分析并進(jìn)行篩選，得到顯著富集（P＜0.01）的通路，并用R語言進(jìn)行KEGG通路富集分析，預(yù)測升降散對COVID-19的潛在作用。

3 結(jié)果

3.1 升降散中活性化合物及對應(yīng)靶點

本研究將OB≥30%、DL≥0.18作為活性成分篩選條件，篩選出活性化合物32種，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集升降散活性成分預(yù)測靶點70個，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫收集靶點382個，合并2個數(shù)據(jù)庫所得靶點，去除重復(fù)靶點，共得靶點437個。其活性化合物和相關(guān)靶點數(shù)見表1。

表1 升降散中活性化合物和相關(guān)靶點數(shù)

續(xù)表（表1）

3.2 升降散治療COVID-19的潛在靶點

通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲得有關(guān)COVID-19的靶點共計259個；將升降散活性成分與COVID-19對應(yīng)靶點輸入到Venny2.0.1在線繪圖工具中，得到升降散治療COVID-19的潛在作用靶點，如圖1所示，升降散作用COVID-19的潛在靶點有30個，占所有靶點的4.5%。

圖1 升降散活性成分靶點-COVID-19靶點韋恩圖

3.3 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape3.7.2軟件把化合物、疾病以及化合物與疾病的交互靶點做“成分－靶點”圖，如圖2所示。節(jié)點越大代表Degree值越大，化合物Degree值排名前5的為蘆薈大黃素（aloe-emodin）、β-谷甾醇（beta-sitoseterol）、草酸銨（Ammonium Oxalate）、麥角胺（Ergotamine）和（＋）-表兒茶素（（-）-catechin）。

圖2 升降散-活性成分-COVID-19-靶點示意圖

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的建立和核心靶點的選取

將升降散與COVID-19的交互靶蛋白導(dǎo)到STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)文件（.tsv格式），將該文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中，保留“node1”“node2”“combination score”的數(shù)據(jù)，選擇工具中的Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3（a）所示。該圖由節(jié)點和邊組成，其中節(jié)點越大、顏色越深，代表“Degree值”越高，則該節(jié)點連接的節(jié)點就越多，可能是治療COVID-19的關(guān)鍵靶點，因此選取“Degree值”排名前15的靶點定義為關(guān)鍵靶點，即TNF、IL1B、TP53、PTGS2、FOS、NFKB1、CCL2、IL10、CASP8、TGFB1、IL13、PPARG、CASP3、BAX和NOS2，關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3（b）所示，節(jié)點數(shù)為15，邊有56條，平均節(jié)點度數(shù)為7.67，平均局部聚類系數(shù)為0.717。

圖3 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)示意圖（圖中節(jié)點越大顏色越深代表“Degree值”越大）

3.5 GO富集與KEGG通路分析

把關(guān)鍵靶點導(dǎo)到DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，得到GO分析條目中有154種生物學(xué)過程（BP）、12種細(xì)胞組成（CC）和21種分子功能（MF），GO功能富集分析各條目功能所占百分比見圖4。

圖4 GO功能富集分析各條目功能所占百分比示意圖

選取排名前10且P＜0.01的功能進(jìn)行可視化分析，如圖5所示，BP占GO功能富集條目的82%，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對機(jī)械刺激的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板、參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活、脂多糖對細(xì)胞的作用、脂多糖參與的信號通路、對抗生素的反應(yīng)、蛋白激酶B信號傳導(dǎo)和對藥物的反應(yīng)的等；CC占7%，包括胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外空間、死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體、細(xì)胞外區(qū)域以及細(xì)胞質(zhì)；MF占11%，包括細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA的結(jié)合、同種的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)的異二聚活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)均二聚活性、蛋白酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合和蛋白質(zhì)結(jié)合。KEGG通路分析中得到51條信號通路，選取P＜0.01且排名前20的進(jìn)行分析，通路基本信息如表2所示，運(yùn)用R語言作通路氣泡圖（圖6），通路名稱展示在Y軸，其所占百分比在X軸展示，通路的富集基因數(shù)由氣泡面積展現(xiàn)，P值的大小由氣泡顏色的深淺呈現(xiàn)。

圖6 升降散關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG排名前20的通路基本信息（P＜0.01）

圖5 GO功能分析中各條目功能中排名前10且P＜0.01的直方圖

4 討論

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對升降散治療COVID-19潛在作用靶點進(jìn)行分析，通過構(gòu)建“成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析得到15個關(guān)鍵靶點，分別為TNF、IL1B、TP53、PTGS2、FOS、NFKB1、

CCL2、IL10、CASP8、TGFB1、IL13、PPARG、CASP3、BAX、NOS2。這些靶點主要來自升降散中成分排名靠前的蘆薈大黃素、β-谷甾醇、草酸銨、麥角胺和（＋）-表兒茶素等化合物。據(jù)報道［11］，蘆薈大黃素具有抗炎、抗菌和抗病毒的藥理活性。Li等［12］研究發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素能夠降低病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變并抑制甲型流感病毒復(fù)制，蘆薈大黃素可能對病毒有一定的抑制作用。β-谷甾醇是動植物細(xì)胞膜的主要組成成分，動物實驗發(fā)現(xiàn)其可通過抑制TNF-α和IL6的釋放和下調(diào)NF-kB通路中的蛋白表達(dá)，對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用［13］。草酸銨是僵蠶中的主要活性成分，具有良好的抗凝血［14］，祛痰定驚等作用［15］。麥角胺是天然麥角堿生物堿的代表，對5-HT1A，5-HT1B／1D，α（2）-腎上腺素能受體和D-2-樣受體具有親和力，具有一定的鎮(zhèn)痛和抗炎作用［16］。（＋）-表兒茶素是一種天然多酚類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎作用，并可干擾四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的進(jìn)程［17］。升降散中的主要成分（蘆薈大黃素、β-谷甾醇、草酸銨、麥角胺和（＋）-表兒茶素）多具有抗炎、抗菌、抗病毒和保護(hù)肺部的作用，進(jìn)一步支持升降散對COVID-19有潛在的療效。

GO功能富集分析中生物進(jìn)程主要是對炎癥、機(jī)械刺激、抗生素、有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)，以及對轉(zhuǎn)錄、凋亡、增殖的調(diào)控。生物過程涉及炎癥相關(guān)靶點有FOS、TNF、CCL2、PTGS2、IL1B，IL13、NFKB1、TGFB1、IL10。脂多糖對細(xì)胞的作用涉及的靶點有TNF、CCL2、NFKB1、NOS2、IL10。脂多糖參與的信號通路涉及的靶點有TNF、CCL2、IL1B、TGFB1。KEGG通路分析中排名前20的通路中有10條通路為病毒和細(xì)菌感染相關(guān)通路，包括查加斯?。绹F蟲病）、結(jié)核、利什曼病、乙型肝炎、單純皰疹感染、百日咳、阿米巴病、弓形蟲病、瘧疾和軍團(tuán)菌??；炎癥相關(guān)通路有TNF信號通路、MAPK信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和炎性腸?。↖BD）等；免疫相關(guān)通路有NOD樣受體信號通路等。

有研究對臨床上的COVID-19患者進(jìn)行臨床檢查［18］，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)的TNF-α、IL10、IL1B等炎癥因子表達(dá)水平異常。李貝金等［19］對新冠肺炎病毒感染人體的文獻(xiàn)進(jìn)行分析，認(rèn)為炎癥與該病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，炎癥因子的增多，會加速組織的損傷。有對升降散治療重癥炎癥患者的研究［20］表明，升降散可以顯著降低患者體內(nèi)的TNF-α、內(nèi)毒素水平。南淑玲等［21］通過研究升降散對小鼠肺炎模型發(fā)現(xiàn)，升降散可降低小鼠體內(nèi)的IL1B和升高抗炎因子IL10的水平而起到治療肺炎的效果。CCL2是一種趨化因子，具有特異性趨化和活化炎癥因子的作用并可誘導(dǎo)炎癥因子聚集到氣道上皮，誘發(fā)氣道炎癥，損傷肺部［22］。NFkB1是一組具有多功能作用的核蛋白因子，可參與炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)以及增殖和凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［23］。NF-κB的激活過程包括涉及TNF-α的細(xì)胞外正反饋途徑和涉及抑制蛋白的細(xì)胞內(nèi)負(fù)反饋途徑，且越來越多的研究表明，TNF-α可以通過激活NFKB信號通路調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡和自噬相關(guān)分子的表達(dá)，從而影響各種細(xì)胞的活性。NFkB1作為NFkB家族重要成員之一，有研究表明升降散可通過抑制肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞NFKB1的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，對肺的急性損傷具有保護(hù)作用［24］。TGFB1是一種轉(zhuǎn)化生長因子，可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞增殖與活化，使細(xì)胞外基質(zhì)沉積并抑制其降解，促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生［25］。TNF信號通路、MAPK信號通路作為經(jīng)典的炎癥通路，被激活后，對肺部可造成一定的損傷［26］。NOD樣受體信號通路［27］是機(jī)體先天免疫應(yīng)答的一部分，可介導(dǎo)促炎因子的釋放、介導(dǎo)免疫應(yīng)答和病毒的入侵。通過對升降散中活性成分與抗病毒相關(guān)靶點的分析，發(fā)現(xiàn)其具有潛在的抗病毒作用。由此推測，升降散可能主要通過炎癥相關(guān)通路的FOS、CASP3、

TNF、CCL2、PTGS2、CASP8、IL1B、NFKB1、TP53、TGFB1靶點；免疫相關(guān)通路的TNF、CCL2、CASP8、IL1B、NFKB1靶點發(fā)揮治療COVID-19的作用。通過以上分析，升降散可能作用多個靶點，尤其是炎癥因子靶點，發(fā)揮抗炎和保護(hù)肺部等的作用。

5 結(jié)論

升降散中蘆薈大黃素、β-谷甾醇、草酸銨、麥角胺和（＋）-表兒茶素可能是治療COVID-19的有效成分，其作用機(jī)制可能是作用多個靶點，尤其是炎癥因子，干擾病毒和細(xì)菌感染相關(guān)通路，發(fā)揮抗炎、抗病毒的作用。因此，升降散通過多靶點、多通路起到抗病毒、抗炎的作用，從而對COVID-19達(dá)到治療的效果。