高生智，潘永紅*，梁 斌，詹 芳，史萬貴，李有全

（1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730030）

2019—2020年甘肅省部分地區(qū)的羊只出現(xiàn)了以貧血、高熱、消瘦、出血和體表淋巴結(jié)腫大為主要特征的臨床癥狀，呈點(diǎn)狀散發(fā)，屬地方性動(dòng)物疫病，初步懷疑為羊泰勒蟲病。為進(jìn)一步了解臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣等地區(qū)羊泰勒蟲病病原感染情況，于2020年3—5月對(duì)以上4個(gè)縣患病羊只進(jìn)行了羊耳尖血涂片，并采集羊血液，一一對(duì)應(yīng)編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行血液涂片染色鏡檢和羊泰勒蟲PCR檢測(cè)。對(duì)鏡檢有典型蟲體、有疑似蟲體和部分鏡檢陰性血液涂片對(duì)應(yīng)的全血樣品進(jìn)行羊泰勒蟲PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：永靖縣、榆中縣、臨潭縣的羊泰勒蟲病是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合感染，而華池縣羊泰勒蟲病是單一的尤氏泰勒蟲感染，證實(shí)了臨床懷疑診斷?，F(xiàn)將試驗(yàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血片 來自臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣，每縣90張。于羊耳尖采血推制血片，自然風(fēng)干，甲醇固定，吉姆薩染色。

1.1.2 全血 來自臨潭縣、永靖縣、華池縣、榆中縣，每縣90份。于羊頸靜脈采血，搖勻，帶回實(shí)驗(yàn)室凍存待檢。

1.1.3 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根公司，批號(hào)20200618。

1.1.4 普通PCR試劑 引物兩對(duì)，尤氏引物、呂氏引物；DNA聚合酶（premix Tap），DEPC水，dNTP，標(biāo)準(zhǔn)DNA（Marker），上樣緩沖液，1%瓊脂糖凝膠，常規(guī)電泳液。

1.1.5 移液器和槍頭 2 μl、10 μl、50 μl、100 μl、200 μl、1 000 μl單道移液器，高壓滅菌配套槍頭。

1.1.6 其他 顯微鏡、生物安全柜、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 血片 常規(guī)顯微鏡鏡檢。鏡檢20高倍以上野，發(fā)現(xiàn)5個(gè)以上典型蟲體為有典型蟲體；發(fā)現(xiàn)1～2個(gè)疑似蟲體為有疑似蟲體；未發(fā)現(xiàn)蟲體為無蟲。

1.2.2 全血 按試劑盒說明書提取DNA模板，普通PCR鑒定。

試驗(yàn)成立：電泳結(jié)束后，陽性對(duì)照樣品應(yīng)出現(xiàn)2條帶，分別為303 bp和530 bp。陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶。否則，此次試驗(yàn)視為無效。

陽性判定：如果待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物在303 bp和（或）530 bp處出現(xiàn)條帶，則為陽性。如出現(xiàn)2條帶，則判定該待檢樣品為兩種泰勒蟲陽性；如出現(xiàn)1條帶，則判定該待檢樣品為相對(duì)應(yīng)的泰勒蟲陽性。

陰性判定：如待檢樣品無擴(kuò)增條帶，判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 血片

如表1所示，通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)地區(qū)患病羊只的蟲體檢出率不同，臨潭縣最高，為68.42%，華池縣最低，為36.67%。

表1 4個(gè)地區(qū)蟲體檢出結(jié)果

2.2 全血

如表2所示，4個(gè)地區(qū)患病羊只蟲體感染率不同，除華池縣以外，其余3個(gè)縣的患病羊只都同時(shí)感染2種泰勒蟲。

表2 4個(gè)地區(qū)樣本泰勒蟲PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 血片對(duì)應(yīng)全血

從表3中可以看出，鏡檢有蟲、PCR確認(rèn)有泰勒蟲的比例為45.90%（56/122），鏡檢有蟲、PCR確認(rèn)無泰勒蟲的比例為16.39%（20/122），鏡檢無蟲、PCR確認(rèn)有泰勒蟲的比例為27.87%（34/122），鏡檢無蟲、PCR確認(rèn)無泰勒蟲的比例為9.84%（12/122），鏡檢與PCR結(jié)果一致率為55.74%（68/122），鏡檢與PCR結(jié)果不一致率為44.26%（54/122）。

表3 4個(gè)地區(qū)樣本泰勒蟲鏡檢結(jié)果 單位：個(gè)

3 分析與討論

在華池縣檢測(cè)到尤氏泰勒蟲，在榆中縣、永靖縣、臨潭縣檢測(cè)到呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲，確認(rèn)了榆中縣、永靖縣、臨潭縣羊泰勒蟲病是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合感染；華池縣羊泰勒蟲病是單一的尤氏泰勒蟲感染。調(diào)查4縣平均陽性率為44.95%，優(yōu)勢(shì)蟲種為尤氏泰勒蟲，其次是呂氏泰勒蟲。

羊泰勒蟲病在甘肅分布廣泛[1-4]，各地感染率、發(fā)病率、死亡率存在明顯差異。此次鏡檢平均陽性率為62.3%（76/122），PCR平均陽性率為73.77%（90/122），鏡檢與PCR結(jié)果一致率為55.74%（68/122）。

在羊泰勒蟲病流行病學(xué)調(diào)查中，長(zhǎng)期沿用采血涂片染色鏡檢的方法是急性發(fā)病病例確診的經(jīng)典方法[1-4]，但在大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查時(shí)稍顯不足，尤其是紅細(xì)胞染蟲率偏低時(shí)易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，血液涂片染色檢查要求操作人員熟練掌握制片技術(shù)，熟悉羊泰勒蟲、無漿體的蟲體形態(tài)和大小，否則當(dāng)出現(xiàn)混合感染時(shí)易造成誤檢漏檢。此次4縣鏡檢誤差率為44.26%（54/122）。

國(guó)外報(bào)道的羊泰勒蟲有4個(gè)種，即萊氏泰勒蟲、綿羊泰勒蟲、分離泰勒蟲和隱藏泰勒蟲，其中萊氏泰勒蟲具有致病性，由其引起的泰勒蟲病也稱惡性泰勒蟲病。自1958年我國(guó)四川甘孜藏族自治州報(bào)道該病以來，甘肅、青海、寧夏、陜西、遼寧、內(nèi)蒙古陸續(xù)報(bào)道有該病發(fā)生[5-7]。殷宏等（2002）通過系統(tǒng)研究后發(fā)現(xiàn)，我國(guó)羊泰勒蟲病的病原并非萊氏泰勒蟲，而是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲。同時(shí)證實(shí)甘肅省夏河縣、寧縣、天?？h羊的泰勒蟲是單一的呂氏泰勒蟲，在臨潭縣、張家川縣及青海省湟源縣的羊泰勒蟲是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合[5]。筆者再次證實(shí)了永靖縣、榆中縣、臨潭縣羊泰勒蟲是呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的混合；華池縣羊泰勒蟲是尤氏泰勒蟲，從而得知甘肅省羊泰勒蟲病的病原是尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲。