郭麗，陳皓，賈明璐，于曉濤，李森森，王瑞

漯河市第一人民醫(yī)院 藥學部/河南省工程研究中心，河南 漯河 462005

缺血性腦卒中是在多種因素共同作用下導致的腦動脈血流中斷，造成局部腦組織缺氧甚至壞死，具有高發(fā)病率、高致殘率及高病死率等特征[1-2]。其病因復雜[3]，即使在獲得有效治療后，大部分患者會留下不同程度的后遺癥，嚴重降低患者的生活質(zhì)量[4]?；謴推谑侨毖阅X卒中治療的關(guān)鍵時期[5]。中醫(yī)認為率中的病機在于脈絡(luò)痹阻[6]，氣虛血瘀是中風恢復期的常見病型[7]。

經(jīng)典名方“補陽還五湯”能顯著改善患者神經(jīng)功能和血流狀態(tài)[8-9]。歸芪通脈合劑是補陽還五湯的加減方，由黃芪、赤芍、當歸、紅花、陳皮等14味中藥組成，具有補氣活血、化瘀通脈的功效，是根據(jù)漯河市中心醫(yī)院臨床經(jīng)驗方研制而成的新制劑，用于治療缺血性腦卒中恢復期的言語謇澀、肢體麻木等。以黃芪為君藥，補益元氣以行血，瘀去而血通，輔以當歸活血養(yǎng)血，赤芍化瘀止痛，全方配伍重用活血行氣藥配合通經(jīng)活絡(luò)之品，補則不滯，溫則不燥。根據(jù)各藥所含成分的理化性質(zhì)并結(jié)合中醫(yī)臨床用藥的特點，采用層次分析(analytic hierarchy process，AHP)結(jié)合正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，為歸芪通脈合劑的深入研究及生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC 20AD型HPLC儀[包括二元泵、可制冷自動進樣器、二極管陣列檢測器(PDA)、柱溫箱、色譜工作站]、AUW-120D型十萬分之一電子天平(日本Shimadzu公司)；1260型HPLC儀(包括四元泵、紫外檢測器、柱溫箱、自動進樣器、色譜工作站，美國Agilent公司)；5810R型高速離心機(美國Eppendorf公司)；智能恒溫數(shù)顯電加熱套(天津泰斯特科技有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮科技有限公司)；SB25-12D型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)；Milli-Q型超純水機(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

對照品黃芪甲苷(批號：MUST-19091308，純度：99.89%)、羥基紅花黃色素A(HSYA，批號：MUST-19091308，純度：98.11%)購自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈為色譜純；甲醇等均為分析純；水為純化水。

黃芪飲片(岷縣歸芪堂藥業(yè)股份有限公司，批號：20181001)；當歸飲片(安徽弘騰藥業(yè)股份有限公司，批號：181101)；紅花飲片(安徽敬道生物科技有限公司，批號：190902)；赤芍飲片(批號：191101)、白僵蠶飲片(批號：191101)、陳皮飲片(批號：181001)均來自安徽藥知源中藥飲片有限公司。各飲片經(jīng)漯河市中心醫(yī)院藥品制劑科于曉濤副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

以揮發(fā)油提取率為評價指標，采用單因素法考察吸水率、浸泡時間、提取時間[10]和料液比[11]對揮發(fā)油提取的影響。

2.1.1吸水率的測定 按處方比例稱取當歸、川芎、陳皮和白術(shù)4味中藥共45 g，加入10倍量的水浸沒，稱質(zhì)量，室溫浸泡90 min，每隔15 min濾過，稱質(zhì)量，并記錄浸泡至透心的時間，計算各時間點中藥的吸水率，結(jié)果見表1。在75 min以后的吸水率無變化，說明其吸水已經(jīng)達到飽和，吸水率為158.35%。因浸泡60 min吸水率達到149.52%，較45 min增長率為12.07%；浸泡75 min吸水率達到158.35%，較60 min增長率為5.91%，從實際生產(chǎn)效率出發(fā)，最終選擇浸泡時間為60 min。

表1 歸芪通脈合劑中藥不同浸泡時間的吸水率

2.1.2提取時間考察 按處方比例稱取當歸等含油中藥2份，每份45 g，加入10倍量水，編號1為未浸泡組，直接提取揮發(fā)油，編號2為浸泡組，浸泡60 min后提取揮發(fā)油，考察不同提取時間揮發(fā)油的提取率，每隔1 h記錄揮發(fā)油的累計提取量，計算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見表2。浸泡組較未浸泡組揮發(fā)油提取率稍高，最終選擇采取浸泡60 min后進行揮發(fā)油的提取。

(1)

表2 歸芪通脈合劑不同提取時間的揮發(fā)油提取率 %

2.1.3料液比的考察 按處方比例稱取當歸等含油中藥4份，每份45 g，結(jié)合吸水率，按照6、8、10、12倍的料液比，依次加入7.58、9.58、11.58、13.58倍水，浸泡60 min，提取5 h，記錄揮發(fā)油的累計提取量，計算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見表3。加水為8倍(實加9.58倍)時揮發(fā)油提取率最高，綜合吸水率和生產(chǎn)加水量的因素，最終確定最佳料液比為1∶10。

表3 歸芪通脈合劑不同料液比的揮發(fā)油提取率

2.1.4揮發(fā)油提取工藝驗證實驗 按處方比例稱取當歸等含油中藥3份，每份45 g，分別加入10倍量水，浸泡1 h，蒸餾提取5 h，測定揮發(fā)油提取量并計算其提取率。結(jié)果表明，揮發(fā)油的平均提取率為0.89%，RSD為0.65%，與單因素試驗結(jié)果相近，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

2.2 正交試驗設(shè)計

當歸等含油中藥進行揮發(fā)油提取后，收集的蒸餾水另器保存，濾過，水提液存留，濾渣與黃芪、黨參、桃仁、紅花等其余10味中藥共水提取，經(jīng)單因素預實驗，選擇提取時間、提取次數(shù)、料液比為考察因素，按照L9(34)進行提取(表4)，加入相應倍量的水，浸泡60 min后，回流提取一定時間后，濾過，合并濾液，65 ℃減壓濃縮并定容至200 mL，備用。

表4 歸芪通脈合劑水提因素水平

選取黃芪甲苷含量、HSYA和干膏得率的綜合評分為指標，優(yōu)選最適宜的共水提取的工藝條件[12]。

2.3 干膏得率的測定

精密吸取各樣品濃縮液3份，每份25 mL，置于質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，按照浸出物測定法(《中華人民共和國藥典》2020年版四部中藥浸出物測定法)測定，精密稱定干膏質(zhì)量，并計算干膏得率，求出RSD。

(2)

式中，W為干膏質(zhì)量；V為濃縮液體積；M為中藥干質(zhì)量。

2.4 指標成分黃芪甲苷的含量測定

2.4.1對照品溶液的制備 精密稱定黃芪甲苷對照品10.01 mg于5 mL量瓶中，加甲醇制成對照品儲備液，質(zhì)量濃度為2.00 mg·mL-1。吸取250 μL黃芪甲苷對照品儲備液和750 μL甲醇，配成質(zhì)量濃度為0.50 mg·mL-1的對照品溶液。

2.4.2供試品溶液的制備 分別精密吸取2.2項下由正交設(shè)計得到的9種樣品的濃縮液5 mL，用水飽和的正丁醇振搖萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨液15 mL，靜置2 h，棄去氨液，分取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，4000 r·min-1(離心半徑為18.7 cm)離心10 min，取上清液，得到9種供試品溶液。

2.4.3陰性對照溶液的制備 按處方比例稱取當歸等含油中藥，揮發(fā)油提取后，蒸餾水另器保存，水提液存留，濾渣與除黃芪外的9味中藥共水提取，加入10倍量水，提取2次，每次1 h，減壓濃縮至200 mL。按2.4.2項下方法制備陰性對照溶液。

2.4.4色譜條件 Agilent Zobax SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，霧化載氣流速為1.59 L·min-1；以乙腈-水(32∶68)為流動相進行等度洗脫[13]，流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。

2.4.5線性關(guān)系的考察 分別精密吸取對照品溶液2、5、8、12、16 μL，進樣測定，以外標兩點法對數(shù)計算，以黃芪甲苷峰面積的對數(shù)值為縱坐標(Y)，以進樣量的對數(shù)值為橫坐標(X)，進行線性回歸，得到線性方程：Y=1.840 8X+2.203，r=0.998 5，表明黃芪甲苷進樣量在1.001～8.008 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.6專屬性試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液(編號4)、缺黃芪的陰性對照溶液各5 μL，在2.4.4項下色譜條件下分別進樣，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，陰性對照品圖譜與對照品、供試品圖譜中黃芪甲苷相應的保留時間無其他峰干擾，表明陰性無干擾。

注：A.對照品；B.供試品(編號4)；C.陰性對照；1.黃芪甲苷。圖1 黃芪甲苷對照品、供試品和陰性對照品色譜圖

2.4.7精密度試驗 精密吸取同一黃芪甲苷對照品溶液，在2.4.4項下色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定峰面積，峰面積的RSD為0.63%。

2.4.8重復性試驗 取同一批樣品(編號4)6份，按2.4.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定含量。結(jié)果黃芪甲苷平均質(zhì)量分數(shù)為0.08%，RSD為1.39%。

2.4.9加樣回收率試驗 精密量取已知黃芪甲苷含量的樣品溶液(編號4)9份，每3份為一水平，分別精密加入黃芪甲苷對照品0.550 6、1.101 1、1.651 7 mg，按2.4.2項下方法制成供試品溶液，分別進樣測定，得平均回收率為98.94%，RSD為2.81%(表5)。

表5 黃芪甲苷的加樣回收率結(jié)果

2.5 指標成分HSYA的含量測定

2.5.1對照品溶液的制備 精密稱定HSYA對照品2.00 mg于2 mL量瓶中，加甲醇制成對照品儲備液，質(zhì)量濃度為1.00 mg·mL-1，吸取甲醇適量，稀釋對照品儲備液，依次配成981.10、245.30、61.32、15.33、12.26 μg·mL-1的對照品溶液。

2.5.2供試品溶液的制備 分別精密量取2.2項下得到的9種濃縮液1 mL，置于5 mL量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，12 000 r·min-1(離心半徑為9.5 cm)離心10 min，取上清液即得9種供試品溶液，置于4 ℃冰箱避光密封保存，備用。

中國無機鹽工業(yè)協(xié)會鉀鹽鉀肥分會會長、青海鹽湖工業(yè)股份有限公司黨委書記、董事長王興富表示，中國鉀肥產(chǎn)業(yè)在創(chuàng)新氛圍中實現(xiàn)了快速發(fā)展。他說：“近年來，在國家發(fā)改委、科技部、自然資源部以及青海省直各部門等多個專項項目支持下，通過原始創(chuàng)新、集成創(chuàng)新與引進消化吸收在創(chuàng)新并舉，自助探索與產(chǎn)學研相結(jié)合，鹽湖股份公司實現(xiàn)了多項先進技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，形成了第三代氯化鉀工業(yè)技術(shù)。察爾汗鉀資源總利用率由初期的不足30%提高至70%以上，加工廠綜合回收率由60%提升至90%，產(chǎn)品品位KCl含量由不足90%提高到98%。察爾汗鹽湖鉀鹽開發(fā)由年產(chǎn)100萬噸服務38年增加至年產(chǎn)500萬噸服務47年，保障鹽湖鉀肥可持續(xù)發(fā)展。”

2.5.3陰性對照品溶液的制備 按處方比例量稱取當歸等含油中藥，揮發(fā)油提取后，蒸餾水另器保存，水提液存留，濾渣與除紅花外的9味中藥共水提取，加入10倍量的水，提取2次，每次1 h，減壓濃縮至200 mL。按照2.5.2項下方法制備陰性對照品溶液。

2.5.4色譜條件 采用Gemini Phenomenex-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，采用PDA進行全波長(190～800 nm)掃描，在403 nm波長下響應值最高，故確定HSYA最佳波長為403 nm。以0.1%磷酸水為流動相A，乙腈為流動相B進行梯度洗脫(0～5 min，15%～20%B；5～10 min，20%～22%B；10～20 min，22%B；20～40 min，22%～80%B；40～45 min，80%B)[14]。流速為0.8 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為5 μL。

2.5.5線性關(guān)系考察 以HSYA峰面積值為縱坐標(Y)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，得到線性方程：Y=14 319X+120 442，r=0.999 8，表明HSYA在12.26～1000.00 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.5.6專屬性試驗 精密吸取HSYA對照品溶液、供試品溶液、缺紅花的陰性對照溶液各5 μL，在2.5.4項下色譜條件下分別進樣，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果顯示，陰性對照品圖譜與對照品、供試品圖譜中HSYA相應的保留時間無其他峰干擾，表明陰性無干擾。

注：A.對照品；B.供試品(編號4)；C.空白溶劑對照；1.HSYA。圖2 HSYA對照品、供試品和陰性對照色譜圖

2.5.7精密度試驗 精密吸取同一樣品(編號4)制備的供試品溶液，在2.5.4項下色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定峰面積，峰面積的RSD為0.46%。

2.5.8重復性試驗 取同一樣品(編號4)，按2.5.2項下方法制備6份供試品溶液，分別進樣測定含量。結(jié)果HSYA平均質(zhì)量分數(shù)為1.18%，RSD為1.90%。

表6 HSYA的加樣回收率結(jié)果

2.6 層次分析法確定權(quán)重

根據(jù)復方中藥味君、臣、佐、使配伍規(guī)律，本實驗將干膏得率和指標性成分含量作為權(quán)重指標予以量化，建立指標的順序為黃芪甲苷含量>HSYA含量>干膏得率，采用1～9標度法對3項指標進行兩兩比較，評判重要性[15-16]，見表7。使用一致矩陣法構(gòu)建優(yōu)先矩陣，見表8。黃芪甲苷含量相對于干膏得率明顯重要，相對權(quán)重記為5分；黃芪甲苷含量相對于HSYA含量稍重要，相對權(quán)重記為3分。HSYA含量的重要性介于黃芪甲苷含量和干膏得率之間，故相對權(quán)重記為2分；反向成對比較時，按其對應的倒數(shù)。

表7 歸芪通脈合劑目標樹各層次評分標準

表8 歸芪通脈合劑指標成分對比判斷優(yōu)先矩陣

(3)

2.6.2歸一化權(quán)重系數(shù)(wi) 根據(jù)公式(4)計算歸一化權(quán)重系數(shù)(wi)。

(4)

2.6.3一致性檢驗 根據(jù)矩陣最大特征根公式(5)～(6)，計算隨機一致性比率。

(5)

(6)

(7)

式中，m為受檢驗層次的次目標數(shù)，CI為一致性檢驗因子，RI為平均隨機一致性指標，CR為矩陣最大特征根，表示一致性比例因子。

經(jīng)計算，CR=0.003<0.1，表明此3項指標優(yōu)先比較矩陣滿足一致性要求，計算的權(quán)重系數(shù)合理有效[17]。因此，黃芪甲苷含量、HSYA質(zhì)量分數(shù)和干膏得率的權(quán)重系數(shù)分別定為0.648 3、0.229 7、0.122 0。

2.7 正交試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果

結(jié)果見表9～10。

表9 歸芪通脈合劑水提工藝正交試驗結(jié)果

表10 歸芪通脈合劑水提工藝方差分析結(jié)果

極差分析結(jié)果表明，各因素對歸芪通脈合劑的水提取實驗結(jié)果影響大小依次為A>C>B。方差分析結(jié)果表明，因素A對綜合評分影響差異有統(tǒng)計學意義(影響順序為A3>A2>A1)，因素C、因素B對綜合評分影響差異無統(tǒng)計學意義。因此，水提最佳條件為A2B1C3，同時結(jié)合生產(chǎn)的能耗，綜合考慮最佳的工藝條件為A2B1C2：當歸、川芎等含油中藥加入10倍量的水，浸泡60 min，提取5 h，收集蒸餾液，濾過，水提液保留。濾渣與其余10味藥材共水提取(紅花后下)，加熱回流提取2次，每次提取1 h，首次加入12倍量的水，第二次加入10倍量的水，趁熱濾過，濾液與上述水提液、蒸餾液合并，棄濾渣。對濾液采用65 ℃減壓濃縮，相對密度約為1.06，定容至體積為200 mL。

2.8 驗證實驗

按處方比例量稱取當歸、川芎等含油中藥45 g，按照篩選得到的最佳提取工藝進行3次驗證，分別測定濃縮液的黃芪甲苷含量、HSYA含量和干膏得率，結(jié)果黃芪甲苷質(zhì)量分數(shù)分別為0.180%、0.185%、0.184%，平均值為0.18%，RSD為1.41%；HSYA質(zhì)量分數(shù)分別為1.46%、1.45%、1.50%，平均值為1.47%，RSD為1.96%；干膏得率分別為34.97%、35.48%、35.41%，平均干膏得率為35.29%，RSD為0.78%，綜合評分分別為97.39、99.14、99.65，平均值為98.73，RSD為1.20%。與正交試驗的最大值結(jié)果相接近，表明該優(yōu)選提取工藝條件合理，穩(wěn)定可行。

3 討論

本方中黃芪為君藥，黃芪甲苷是其發(fā)揮藥理活性重要的有效成分，選擇其作為含量測定的評價指標，既能反映有效成分的提取情況，又能在一定程度上有效控制藥品質(zhì)量。紅花主要活性成分HSYA的含量隨著時間的增長而減少，可能是因為HSYA是水溶性成分，紅花在水中的吸溶劑率高，使HSYA更快地被提取出來，所以實際煎煮過程中考慮將紅花后下[18]。本實驗還對黃芪甲苷和HSYA的含量測定分別進行了方法學考察，結(jié)果RSD均小于3.0，表明檢測方法準確可靠。

本方中當歸、川芎為臣藥，當歸揮發(fā)油內(nèi)酯類對大鼠神經(jīng)功能缺失、腦血管痙攣等有顯著保護作用[19-20]，川芎中生物堿川芎嗪具有抗血小板聚集、改善神經(jīng)功能損傷等作用[21]。故擬定當歸、川芎等含油中藥蒸餾提取，藥渣與黃芪、赤芍等加水共提。對含油中藥進行揮發(fā)油的提取后，本方中剩余中藥主要有效成分均為水溶性成分，提取工藝采用水提法，所得干膏得率是評價中藥中主要成分含量和品質(zhì)優(yōu)劣的一項重要指標，亦是制劑質(zhì)量的依據(jù)，干膏得率的穩(wěn)定是制劑成型的重要保證[22]。

中藥復方制劑具有多系統(tǒng)、多靶點綜合發(fā)揮作用的特點，采用多指標權(quán)重分析法對處方工藝進行優(yōu)化，權(quán)重系數(shù)的賦予是評價綜合評分標準的科學性與合理性的直接體現(xiàn)[23]。根據(jù)AHP建立對比判斷優(yōu)先矩陣，獲取各指標的相對評分。

采用AHP聯(lián)合正交設(shè)計試驗優(yōu)化了歸芪通脈合劑的水提工藝，并結(jié)合實際產(chǎn)能優(yōu)化提取工藝，經(jīng)驗證工藝穩(wěn)定，不僅為歸芪通脈合劑的進一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)，也使得制劑臨床應用更加有效。