李玥，吳文靜，甘璐，成睿珍

天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，天津 300450

腸系膜淋巴結(jié)炎為兒科臨床常見病，多發(fā)于7歲以下兒童，且男孩發(fā)病率高于女孩[1-2]。臨床上主要表現(xiàn)為腹痛，有時(shí)可伴有嘔吐、腹瀉、腹脹、便秘、食欲不振等癥狀，部分患兒還可能有白細(xì)胞升高、發(fā)熱等表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患兒的身心健康和生長(zhǎng)發(fā)育[3-4]。然而，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏行之有效的治療方法，目前多采用控制飲食、靜脈滴注或口服抗生素抗感染、抗病毒、解痙止痛等治療手段[5-6]，雖可緩解眼前腹痛癥狀，但治標(biāo)不治本，不良反應(yīng)大，患兒極易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致腹痛再次發(fā)作，甚至引起其他疾病。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腸系膜淋巴結(jié)炎有寒、熱、虛、實(shí)之分，病因多有內(nèi)外之別。小兒由于臟腑嬌嫩、形氣未充、衛(wèi)外功能不固、對(duì)寒暖不能自調(diào)，外易為六淫所侵，內(nèi)易為飲食所傷，臨床辨證多分為寒凝中焦、乳食積滯、臟腑虛寒、氣滯血瘀等證型，治療上多采用溫中散寒、消食導(dǎo)滯、溫中補(bǔ)虛、理氣化瘀等治則[7-10]。

本研究選用天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院兒科常用于治療小兒腸系膜淋巴結(jié)炎的中藥貼敷處方。此方結(jié)合臨床辨證施治，已在臨床廣泛應(yīng)用10余年，并取得良好療效。處方主要由吳茱萸、木香、肉桂、丁香和小茴香等9味中藥組成，功效為溫中散寒、緩急止痛，主要用于治療脾胃虛弱，感受寒邪，寒凝氣滯導(dǎo)致的腹痛、腹瀉、嘔吐、厭食等癥。辯證要點(diǎn)為食欲差、腹痛、腹脹，遇冷則重，得溫則減，嘔吐食物或清水，或大便溏，苔白或白膩。

方中吳茱萸味辛，性熱，歸肝、胃經(jīng)，散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉；木香味辛、苦，性溫，歸脾、胃、大腸、三焦經(jīng)，辛行氣滯、苦消氣結(jié)、行氣止痛、健脾消食；丁香具有溫中降逆、散寒止痛、溫腎助陽(yáng)之效；小茴香味辛，性溫，歸脾胃肝經(jīng)，理氣和胃、開胃健脾；延胡索味辛苦，性溫，活血祛瘀、行氣止痛。諸藥合用，理氣濕中、散寒止痛，共奏溫中芳香、利濕止痛之功，配合口服中藥湯劑及西醫(yī)抗生素抗炎等治療方法，能夠有效地治療小兒腸系膜淋巴結(jié)炎[11]。

1 材料

1.1 儀器

LC20A型高效液相色譜系統(tǒng)[LC-20AD泵、SIL-20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器、CTO-20A型柱溫箱、CBM20Alite型控制器、DGU-20A3R(C)型脫氣機(jī)、LabSolutions色譜工作站，日本島津公司]；AL-204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300DE型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為DC-18031410、DC-18031411、DC-17101310、DC-17101311，純度≥98%)；對(duì)照品桂皮醛和丁香酚(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)分別為BWB52030、BWB50285，純度≥98%)；超純水為自制；甲醇為色譜純。

小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中藥復(fù)方包括吳茱萸、木香、丁香、肉桂、小茴香等9味中藥飲片，由天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)科提供，經(jīng)劉海副主任中藥師鑒定，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方水提液的制備

小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中藥復(fù)方由吳茱萸20 g、木香20 g、丁香10 g、肉桂10 g、蒼術(shù)20 g、小茴香20 g、車前子10 g、延胡索20 g和白胡椒30粒組成。

稱取以上9味中藥飲片，粉碎為粗粉后置于圓底燒瓶中，隨后分別加入適量的蒸餾水，浸泡30 min后，開啟電熱套進(jìn)行回流提取，趁熱濾過(guò)，濃縮至適量，放冷至室溫，加水定容至500 mL，混勻，備用。

2.2 指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.2.1供試品溶液的制備 分別精密移取以上水提液1 mL，用無(wú)水甲醇稀釋2倍，混勻，醇沉，濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.2.2色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～7 min，39%A；7～15 min，39%～58%A；15～38 min，58%A；38～40 min，58%～79%A；40～52 min，79%A；52～52.5 min，79%～39%A；52.5～65 min，39%A)；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為200～400 nm；進(jìn)樣量為10 μL。色譜圖見圖1。

注：A.空白溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.吳茱萸堿；2.木香烴內(nèi)脂；3.去氫木香烴內(nèi)脂；4.桂皮醛；5.丁香酚；6.吳茱萸次堿。圖1 空白溶液、混合對(duì)照品及小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中藥復(fù)方湯劑供試品溶液的HPLC圖

2.2.3對(duì)照品溶液的制備 分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，用70%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻。得質(zhì)量濃度分別為38.70、19.40、61.36、74.00、70.20、677.56 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.4陰性供試品溶液的制備 稱取含指標(biāo)成分以外的其他藥味，按2.1和2.2.1項(xiàng)下方法制備陰性供試品。

2.2.5線性關(guān)系考察 精密移取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用70%甲醇逐級(jí)稀釋，制成一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和峰面積。分別以各指標(biāo)成分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程分別為吳茱萸堿Y=29 997.55X+9 984.91(r=1.000 0)、吳茱萸次堿Y=71 925X+170 22(r=0.999 6)、木香烴內(nèi)酯Y=24 169.895X+21 941.38(r=0.999 6)、去氫木香烴內(nèi)酯Y=13 531.06X+11 520.07(r=0.999 6)、桂皮醛Y=36 052X+34 794(r=0.999 6)和丁香酚Y=2 910 800X+120 550(r=0.999 6)，其線性范圍分別為0.604 7～38.700 0、0.001 1～19.400 0、0.003 7～61.360 0、0.004 6～74.000 0、0.004 4～70.200 0、0.040 0～677.560 0 μg·mL-1。以上結(jié)果表明，各成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度試驗(yàn) 精密吸取高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定6種成分的峰面積，計(jì)算各成分的含量，求日內(nèi)、日間精密度。吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚的日內(nèi)精密度RSD分別為 0.72%、1.14%、1.20%、1.81%、1.06%和1.00%。日間精密度的RSD分別為 1.73%、2.60%、2.07%、2.90%、2.04%和1.97%。結(jié)果表明，儀器的日間、日內(nèi)精密度良好。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取處方按2.1項(xiàng)下方法制備水提液，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試液共6份，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚6種成分的峰面積，計(jì)算各成分含量的RSD分別為1.19%、2.14%、1.29%、2.69%、1.70%和1.26%。結(jié)果表明，此法重復(fù)性良好。

2.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 取處方按2.1項(xiàng)下方法制備水提液，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚6種成分的峰面積，計(jì)算各成分含量的RSD分別為0.20%、0.29%、1.06%、0.63%、1.12%和0.92%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知6種指標(biāo)成分含量的供試液6份，分別加入等量的對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。測(cè)得吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分別為100.33%、98.90%、100.70%、99.44%、99.42%和102.75%，其加樣回收率的RSD分別為2.05%、1.74%、3.00%、2.85%、1.94%和2.83%，見表1。

表1 小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中藥復(fù)方湯劑中6個(gè)成分加樣回收率結(jié)果

2.3 水提工藝的優(yōu)選

2.3.1單因素考察

2.3.1.1提取溶劑用量的考察 按處方量稱取各味藥，分別加入4、6、8、10和12倍量水回流提取1次，每次1 h，平行3份。按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚的峰面積，計(jì)算各成分的相對(duì)含量。根據(jù)各指標(biāo)含量的變化，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇加水量為8、10和12倍量(圖2)。

圖2 單因素考察加水量對(duì)各指標(biāo)成分提取量的影響

2.3.1.2提取時(shí)間的考察 按處方量稱取各味藥，加入6倍量水，分別回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取1次，平行3份。按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚的峰面積，計(jì)算各成分的相對(duì)含量(圖3)。根據(jù)各指標(biāo)含量的變化，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇提取時(shí)間為1.5、2.0、2.5 h。

圖3 單因素考察提取時(shí)間對(duì)各指標(biāo)成分提取量的影響

2.3.2多指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)的確定 對(duì)處方中君臣佐使及其指標(biāo)成分的含量進(jìn)行分析，將吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚6種成分的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為0.25、0.25、0.15、0.15、0.10和0.10。

2.3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，又將提取次數(shù)作為其中的考察指標(biāo)。采用正交設(shè)計(jì)ⅡⅤ3.1篩選最佳工藝，選擇三因素三水平，按L9(34)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)(表2)。以吳茱萸堿等6種成分為測(cè)定指標(biāo)，采用加權(quán)綜合評(píng)分法，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以指標(biāo)成分含量的綜合評(píng)分值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析(表3)和方差分析(表4)，確定最佳提取工藝。

表2 小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中藥復(fù)方湯劑正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)

表3 小兒腸系膜淋巴結(jié)炎中藥復(fù)方湯劑中6種指標(biāo)成分的正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 中藥復(fù)方湯劑中6種指標(biāo)成分的綜合評(píng)分方差分析

2.3.4多指標(biāo)綜合評(píng)分分析 由表3的R值直觀分析和表4方差分析可知，各考察因素對(duì)考察指標(biāo)影響大小的次序?yàn)镃>A>B，其中C影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A和B在實(shí)驗(yàn)所設(shè)范圍內(nèi)無(wú)差異。綜合正交設(shè)計(jì)結(jié)果、時(shí)間和成本問(wèn)題，得出最佳試驗(yàn)方案為A1B1C3，即8倍量水，提取1.5 h，提取3次。

2.3.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步驗(yàn)證所選最優(yōu)工藝，按照優(yōu)選的水提工藝進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由結(jié)果可知，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、桂皮醛和丁香酚的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為702.25、101.88、102.79、376.17、210.69、1.38 mg·g-1，RSD分別為1.97%、2.11%、2.06%、2.15%、1.67%和1.61%。結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

3.1 考察指標(biāo)及權(quán)重系數(shù)的確定

本研究通過(guò)對(duì)主要藥味的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，根據(jù)復(fù)方中不同藥味的地位分配權(quán)重，進(jìn)行多指標(biāo)成分權(quán)重分析。方中吳茱萸為君藥，其中吳茱萸堿和吳茱萸次堿是其發(fā)揮助陽(yáng)、散寒止痛功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，其可對(duì)醋酸引起小鼠扭體反應(yīng)有鎮(zhèn)痛效果[12]，故將吳茱萸堿和吳茱萸次堿的權(quán)重系數(shù)均定為0.25。臣藥木香辛行氣滯、苦消氣結(jié)，其中具有抗炎、止痛的有效成分為萜類木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯，能夠抑制一氧化氮(NO)的產(chǎn)生和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB的活化[13-15]，故將木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯權(quán)重系數(shù)均定為0.15。肉桂和丁香均為辛香之品，為佐藥，其揮發(fā)性成分桂皮醛和丁香酚能夠溫中散寒、止痛，具有良好的體外抗菌、抗炎作用，不良反應(yīng)小，將其權(quán)重系數(shù)均定為0.1。因此，本研究綜合相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，選擇以上各指標(biāo)作為考察對(duì)象，理論上對(duì)小兒腸系膜淋巴結(jié)炎起到很好的治療作用。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)各指標(biāo)成分的理化性質(zhì)，即吳茱萸堿和吳茱萸次堿為生物堿類，木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴為內(nèi)酯萜類，而桂皮醛和丁香酚為極性較小的揮發(fā)性成分，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的各成分HPLC含量測(cè)定的方法[16-18]，本研究采取梯度洗脫的方法，于不同吸收波長(zhǎng)采集色譜數(shù)據(jù)，測(cè)定各成分的相對(duì)含量。經(jīng)方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，該方法科學(xué)合理、可行穩(wěn)定，適于此復(fù)方中6種指標(biāo)成分的含量測(cè)定。

3.3 提取工藝的優(yōu)選

中藥復(fù)方在傳統(tǒng)的水回流提取工藝研究過(guò)程中，提取時(shí)間、提取次數(shù)和加水量等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響十分重要。為了全面反映該湯劑對(duì)小兒腸系膜淋巴結(jié)炎的作用效果，并將其有效成分充分提取出來(lái)，筆者通過(guò)前期的文獻(xiàn)調(diào)研，結(jié)合單因素考察的結(jié)果，確定正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平，通過(guò)對(duì)主要藥味的有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，根據(jù)復(fù)方中不同藥味的地位分配權(quán)重，進(jìn)行多指標(biāo)成分權(quán)重綜合評(píng)分分析。本研究綜合正交設(shè)計(jì)結(jié)果、時(shí)間和成本問(wèn)題，得出該湯劑的最佳提取工藝為8倍量水，提取3次，每次1.5 h。

此外，本研究在小兒腸系膜炎中藥復(fù)方湯劑的提取工藝實(shí)驗(yàn)研究中，充分考慮方中君、臣、佐、使的配伍原則及其有效成分的藥理特性[19]，運(yùn)用單因素分析結(jié)合正交試驗(yàn)-多指標(biāo)綜合評(píng)分的方法，確定該湯劑的提取工藝并進(jìn)行了驗(yàn)證。該研究具有一定的科學(xué)性，可為后續(xù)制劑工藝的篩選、評(píng)價(jià)新藥的研發(fā)提供參考。