甘龍，李晨晨，薛健，潘瑞樂

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

枸杞子為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目等功效，對虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽萎遺精、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等有一定的改善作用[1]。作為著名的藥食同源物質(zhì)，枸杞子作為食品補(bǔ)充劑出口至美國、歐洲等地。據(jù)統(tǒng)計(jì)，枸杞子年平均出口量超過8000 t，涉及105個(gè)國家和地區(qū)[2]。在我國，枸杞子是重要的保健食品和中成藥原料。截至2020年9月，在國家食品藥品監(jiān)督管理局國產(chǎn)保健食品數(shù)據(jù)庫登記注冊的16 549種保健食品中，含枸杞子的產(chǎn)品達(dá)1645種，約占總數(shù)的10%；在中成藥處方數(shù)據(jù)庫中，以其作為配方組分的中成藥處方超過總量的5.5%。

隨著枸杞子需求量逐年增加，其種植面積不斷擴(kuò)大，蚜蟲、癭蚊、實(shí)蠅等病蟲害對枸杞的危害日益嚴(yán)重[3]。新煙堿、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯等各類農(nóng)藥在枸杞的種植過程中均有使用，這使得枸杞子的農(nóng)藥殘留問題日益嚴(yán)重[4]。目前，文獻(xiàn)報(bào)道使用氣相色譜、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、熒光檢測等多種分析手段建立枸杞子藥材的農(nóng)藥殘留檢測方法，并發(fā)現(xiàn)其中殺蟲脒、多菌靈、克百威等多種農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題[5-11]。

枸杞子直接食用時(shí)，最常見的形式是泡茶或水煮煲湯等；作為保健食品或中成藥原料時(shí)，多采用水提取工藝處理[12]。此外，枸杞子水提取物還作為配方顆粒用于中藥復(fù)方。然而，枸杞子經(jīng)水提取后農(nóng)藥殘留是被富集還是減少尚缺乏深入研究，對枸杞子水提取物的農(nóng)藥殘留檢測方法及其膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估也未見報(bào)道。

本研究從《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版規(guī)定的禁用或限用農(nóng)藥種類、近5年枸杞子出口美國被美國國家食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)自動(dòng)扣留或退回的枸杞子中涉及的農(nóng)藥種類及文獻(xiàn)報(bào)道中枸杞子農(nóng)藥殘留高頻檢出或超標(biāo)的種類中篩選出37種農(nóng)藥，建立枸杞子水提取物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測方法，并對市場隨機(jī)購買的有機(jī)級、綠色級、無公害級、普通級4種不同等級的枸杞子及其水提取物進(jìn)行農(nóng)藥殘留量檢測和風(fēng)險(xiǎn)評估，為枸杞子的食用、藥用安全提供參考。

1 材料

1.1 試藥

石墨化碳氨基復(fù)合固相萃取柱[Carb-NH2，500 mg·(6 mL)-1]、親水親脂平衡固相萃取柱[HLB，200 mg·(6 mL)-1]均購于天津博納艾杰爾公司；37種農(nóng)藥對照品溶液(多菌靈、甲胺磷、涕滅威亞砜、久效磷、涕滅威砜、殺蟲脒、3-羥基克百威、涕滅威、甲磺隆、克百威、苯線磷砜、胺苯磺隆、甲拌磷亞砜、內(nèi)吸磷、特丁硫磷亞砜、三唑醇、甲拌磷砜、水胺硫磷、殺撲磷、蟲螨畏、苯線磷、滅線磷、特丁硫磷砜、馬拉硫磷、三唑磷、氯唑磷、殺螟硫磷、硫線磷、蠅毒磷、甲基異柳磷、治螟磷、地蟲硫磷、甲拌磷、毒死蜱、克螨特、甲氰菊酯、噠螨靈，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)；甲酸、乙腈(質(zhì)譜級，F(xiàn)isher公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏公司)。枸杞子為市售商品，具體信息見表1。

表1 枸杞子樣品信息

1.2 儀器

LC-20A Prominence UFLCXR型液相色譜儀(日本島津公司)；QTRAP 5500型質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Voterx-5型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；ME-104E型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；2-6型臺式低速離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 混合對照品溶液制備

分別精密吸取各農(nóng)藥對照品溶液500 μL，置100 mL量瓶中，乙腈定容至刻度，搖勻，密封，-18 ℃避光保存，作為混合對照品母液使用。

2.2 枸杞子提取物制備

參考文獻(xiàn)[13]農(nóng)藥殘留檢測方法，對購買的不同等級枸杞子進(jìn)行測定，選擇測定結(jié)果中不含本研究37種目標(biāo)農(nóng)藥的樣品作為空白樣品。

取空白樣品粉末100 g，加入蒸餾水800 mL，浸泡30 min，加熱回流提取1 h，濾過；濾渣復(fù)提1次，濾過，合并濾液，濃縮、低溫干燥，即得空白枸杞子水提取物(GOJI-kb)。

不同等級枸杞子提取物的制備：分別取不同等級枸杞子粉末100 g，同空白枸杞子提取物制備方法。分別得有機(jī)食品級枸杞子提取物(GOJI-a)、綠色食品級枸杞子提取物(GOJI-b)、無公害食品級枸杞子提取物(GOJI-c)、普通食品級枸杞子提取物(GOJI-d)。

2.3 不同前處理方法供試品溶液制備

取GOJI- kb粉末適量，準(zhǔn)確加入混合對照品溶液，等量遞增法混合均勻，揮干溶劑，制得各農(nóng)藥殘留量為20 ng·g-1的加標(biāo)樣品，參考《中國藥典》2020年版[14]對不同樣品前處理方法[直接提取法(direct extraction)、快速樣品處理法(QuEChERS)、分散固相萃取法(dispersive solid-phase extraction，dSPE)、親水親脂平衡固相萃取法(HLB SPE)、石墨化碳氨基復(fù)合固相萃取法(Carb-NH2SPE)]進(jìn)行比較及參數(shù)優(yōu)化。

2.4 檢測條件

2.4.1色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫：30.0 ℃；流動(dòng)相：乙腈(含0.1%甲酸，A)-水(含0.1%甲酸，B)，梯度洗脫(0～0.5 min，25%A；0.5～4.0 min，25%～30%A；4.0～8.0 min，30%～55%A；8.0～10.0 min，55%～75%A；10.0～15.0 min，75%～95%A；15.0～15.2 min，95%～25%A；15.2～18.7 min，25%A)；流速：0.20 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。

2.4.2質(zhì)譜條件 以三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，電噴霧離子源(ESI)，監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描模式：正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測時(shí)間窗(MRM detection window)：90 s，掃描時(shí)長(target scan time)：0.9 s，離子噴霧電壓(IS)：+5.5 kV；射入電壓(EP)：10 V；碰撞室射出電壓(CXP)：9 V；離子源溫度：550 ℃，霧化氣(GS1)：344.75 kPa，輔助氣(GS2)：344.75 kPa，氣簾氣(CUR)：137.9 kPa。各化合物監(jiān)測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)見表2。

表2 枸杞水提取物中37種農(nóng)藥質(zhì)譜信息

3 結(jié)果

3.1 樣品前處理方法

以加樣回收率(60%～120%為合格)、試劑用量、處理步驟等作為評估指標(biāo)，如表3所示，dSPE合格的農(nóng)藥品種數(shù)目最多且分析周期短、試劑用量少，可作為進(jìn)一步優(yōu)化的基質(zhì)凈化方法。最終確定的樣本前處理方法：將提取物粉碎，過三號篩，精密稱取1.5 g，置帶蓋離心管中，加入蒸餾水10 mL，渦旋混勻后靜置30 min，準(zhǔn)確加入含1%冰醋酸的乙腈溶液10 mL，渦旋3 min，加入萃取鹽包(其中包含無水乙酸鈉1 g、無水硫酸鎂4 g)，渦旋混勻后4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為11.0 cm)，精密吸取上清液5 mL，置于預(yù)先裝有凈化材料(無水硫酸鎂600 mg，ODS C18300 mg，GCB 120 mg)的帶蓋離心管中，渦旋3 min 使充分混勻，凈化完全，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為11.0 cm)，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

表3 5種前處理方法不同指標(biāo)結(jié)果

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

參考《中國藥典》2020年版[14]，對2.4、3.1項(xiàng)下所述的樣品前處理及檢測方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，37種農(nóng)藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖見圖1，各農(nóng)藥色譜峰峰形較好。

圖1 37種農(nóng)藥基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖

除殺螟硫磷(15%)外，其他精密度RSD均小于6%；重復(fù)性RSD均小于10%；除多菌靈(63%)外，其他加樣回收率為75%～115%；37種農(nóng)藥在0.001～0.100 mg·kg-1線性關(guān)系良好，除殺螟硫磷r為0.975，其他r均大于0.99，滿足農(nóng)藥殘留最大限度測定要求(表4)。

表4 枸杞水提取物中37種農(nóng)藥方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.3 不同等級枸杞子提取物農(nóng)藥殘留量測定

分別將枸杞子水提取物(GOJI-a、GOJI-b、GOJI-c、GOJI-d)按3.1、2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行處理和測定，結(jié)果見表5。經(jīng)水提取后，各提取物中農(nóng)藥殘留總量均有不同程度的降低，其中，殺蟲脒、甲拌磷亞砜、克螨特均未被檢出，但克百威(含3-羥基克百威)的殘留量相對于枸杞子有略微升高。不同等級枸杞子農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果為參考文獻(xiàn)[13]農(nóng)藥殘留測定方法，在篩選枸杞子空白藥材時(shí)測定，結(jié)果見表5。

表5 不同等級枸杞子及提取物農(nóng)藥殘留量 ng·g-1

3.4 膳食風(fēng)險(xiǎn)評估

膳食暴露評估可以判斷食品中各類污染物的風(fēng)險(xiǎn)等級，依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)對膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)的定義，使用點(diǎn)評估方法作為膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估方法，即分為急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)(EXPa)與慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)(EXPc)，采用參考文獻(xiàn)[5]方法計(jì)算，急性參考劑量(ARfD)%≤100%說明風(fēng)險(xiǎn)可以接受，ARfD%>100%說明風(fēng)險(xiǎn)不可接受[15]；每日允許攝入量(ADI)%≤100%說明風(fēng)險(xiǎn)可以接受，ADI%>100%說明風(fēng)險(xiǎn)不可接受[16]。累計(jì)膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)值(RQ)≤100%說明風(fēng)險(xiǎn)可以接受，RQ>100%說明風(fēng)險(xiǎn)不可接受?？税偻?-羥基克百威，甲拌磷含甲拌磷砜及亞砜。殺蟲脒、噠螨靈、克螨特?zé)oARfD值，采用ADI值進(jìn)行EXPa計(jì)算，蟲螨畏ADI值采用ARfD值計(jì)算(表6)。對隨機(jī)購于市面上的不同等級枸杞子及其水提取物農(nóng)藥殘留檢測后進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，結(jié)果表明，37種農(nóng)藥殘留中被檢出的13種農(nóng)藥均處于較低的風(fēng)險(xiǎn)水平，其EXPa與EXPc均小于100%，且RQ均小于100%，枸杞子及其提取物膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)處于可接受范圍。對比不同等級枸杞子，有機(jī)食品級膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)最小，但RQ與食品安全等級未呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，綠色食品級枸杞子及提取物RQ最高。除綠色食品級外，其余3種級別的枸杞子提取物相較于枸杞子，其RQ均有所降低(表7)。

表6 不同農(nóng)藥膳食風(fēng)險(xiǎn)參考劑量

表7 不同等級枸杞子及其提取物膳食風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果 %

4 討論

4.1 檢測指標(biāo)的選取

本研究所選37種農(nóng)藥建立枸杞子水提取物農(nóng)藥殘留檢測品種，主要是基于枸杞種植過程中農(nóng)藥的使用種類、枸杞子農(nóng)藥殘留檢出種類及相關(guān)的法律法規(guī)等確定的。根據(jù)FDA近5年對我國出口美國的枸杞子自動(dòng)扣留或退回情況，枸杞子所涉及的農(nóng)藥殘留檢測品種有多菌靈、殺蟲脒、甲氰菊酯。近年來文獻(xiàn)報(bào)道枸杞子農(nóng)藥殘留超標(biāo)品種，如毒死蜱、久效磷、克百威等，結(jié)合《中國藥典》2020年版[14]禁用或限用農(nóng)藥種類甲胺磷、甲拌磷、內(nèi)吸磷等液質(zhì)檢測品種，既滿足農(nóng)藥殘留檢測研究的科學(xué)性，也兼顧方法的經(jīng)濟(jì)性與普適性。

4.2 儀器檢測方法的優(yōu)化

本研究的儀器檢測方法主要基于《中國藥典》2020年版[14]及枸杞子藥材農(nóng)藥殘留檢測文獻(xiàn)報(bào)道[6，13]，對色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。色譜方法主要對流動(dòng)相初始比例和甲酸體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行微調(diào)，選取75%初始水相比例、乙腈(含0.1%甲酸)和水(含0.1%甲酸)為流動(dòng)相，峰形與分離度較好。質(zhì)譜條件的優(yōu)化則以特征離子對選取為主，如在對多菌靈、蟲螨畏等的檢測時(shí)，枸杞子提取物存在不同于枸杞子藥材的基質(zhì)效應(yīng)，因而采用不同于現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及方法的離子對作為定量離子對，以達(dá)到最佳的檢測靈敏度。同時(shí)，由于相同保留時(shí)間共流出組分較多，導(dǎo)致一級質(zhì)譜對母離子的選擇性差，采用時(shí)間窗(detection window)分段檢測模式，可以進(jìn)一步增強(qiáng)檢測的選擇性和靈敏度，其檢測能力可達(dá)十億分之一濃度級別。

4.3 前處理方法的確定

中藥或農(nóng)產(chǎn)品由于基質(zhì)復(fù)雜，對農(nóng)藥分子在離子源中的電離存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，使部分農(nóng)藥的檢測靈敏度降低，難以達(dá)到農(nóng)藥殘留最大限度要求的定量限[17]。為了提高分析效率、降低基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)減少有毒有害試劑的使用，對樣本前處理方法的改良和優(yōu)化是必要的。本研究通過采用直接提取法、QuEChERS法、dSPE及2種固相萃取小柱凈化法對樣品前處理進(jìn)行對比研究，結(jié)果表明，dSPE農(nóng)藥加樣回收率合格率最高、方法簡便快捷。通過減少無水硫酸鎂的用量、加入GCB等方式改變凈化劑的配比和組成，各農(nóng)藥的加樣回收率達(dá)到測定要求。改良后的方法免去了濃縮步驟，經(jīng)簡單提取、凈化、離心即可，適于推廣使用。

4.4 枸杞子藥材與提取物的農(nóng)藥殘留量存在差異

不同等級枸杞子及其水提物的農(nóng)藥殘留量檢測結(jié)果存在明顯的差異，水提物中檢出的11種農(nóng)藥殘留中僅有克百威(含3-羥基克百威)的殘留量相較于枸杞子有所升高，殺蟲脒、甲拌磷亞砜、克螨特在水提物中未被檢出，毒死蜱、多菌靈、甲氰菊酯、噠螨靈、蟲螨畏、甲拌磷砜、三唑醇在提取物中的殘留量均有不同程度的降低。

查詢PubChem數(shù)據(jù)庫所登記的農(nóng)藥理化信息，毒死蜱、多菌靈、甲氰菊酯、噠螨靈、克螨特等在水中溶解度極低(20 ℃，水溶解度<10 mg·L-1)，而克百威的溶解度為350 mg·L-1。根據(jù)“相似相溶”原則，毒死蜱和多菌靈等很難被水溶出，即不易殘留于水提物中，而克百威易溶于水，意味著其易殘留于水提取物中。本研究結(jié)果表明，毒死蜱、多菌靈等農(nóng)藥在水提取物中均處于極低的殘留水平(<0.01 mg·kg-1)，然而克百威從枸杞子到枸杞子水提取物的轉(zhuǎn)移率高達(dá)91.5%，出現(xiàn)了富集行為，符合其溶解度高的特征。由于克百威屬于高毒農(nóng)藥，在膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估中權(quán)重很大，占RQ的96.6%。不難理解，這也是風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果中枸杞子水提物的農(nóng)藥殘留種類少和總量雖低，但RQ反而增加的原因。上述結(jié)果表明，枸杞子水提取對不同農(nóng)藥殘留的溶出及轉(zhuǎn)移率不同，由于提取后去掉了水不溶雜質(zhì)，使水溶性大的農(nóng)藥殘留相對濃度提高，進(jìn)而影響水提物的安全系數(shù)。由于枸杞子等藥食同源物質(zhì)，主要采用茶飲水煮食用，因此加強(qiáng)對克百威等水溶性大的高毒農(nóng)藥的禁用、監(jiān)管及檢測力度是很有必要的。

5 結(jié)論

本研究建立了枸杞子水提取物中37種農(nóng)藥殘留的UFLC-MS/MS檢測方法，該方法簡便、經(jīng)濟(jì)、快速，可用于枸杞子提取物的農(nóng)藥殘留快速準(zhǔn)確測定。枸杞子加工制備為水提取物時(shí)，農(nóng)藥殘留總量呈現(xiàn)降低水平，膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)也同步下降，為枸杞子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供了新的思路與參考。