呂卓，袁文婷，湯迪，濮存海

1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065；2.延邊大學(xué) 藥學(xué)院，吉林 延吉 133000；3.上海優(yōu)耕農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海 200000；4.中國中藥協(xié)會 中藥新技術(shù)專委會，江蘇 南京 210008

西紅花CrocussativusL.又名藏紅花，藥用部位為花的柱頭，具有活血化瘀等作用[1]。其產(chǎn)量較低，90朵花能得到1 g左右的干燥柱頭，副產(chǎn)物花瓣都被丟棄[2]。西紅花非藥用部位的藥理作用和化學(xué)成分也多有報道?，F(xiàn)代藥理研究表明，西紅花非藥用部位具有抗氧化作用[3-5]、抗真菌與細(xì)胞毒作用[6]、心血管系統(tǒng)保護(hù)作用[7]、肝臟和腎臟保護(hù)作用[8]等。文獻(xiàn)研究表明，西紅花非藥用部位中含有多種化學(xué)成分。王曉萌等[9]采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析西紅花花瓣和雄蕊中的揮發(fā)油成分，在花瓣中鑒定出16個化合物，雄蕊中鑒定出20個化合物。高文運等[10]從西紅花側(cè)芽中分離得到4個蒽醌類化合物。宋純清[11]從西紅花的花被中分離出5個黃酮醇類化合物。除此之外，西紅花非藥用部位中還含酚酸類[12]和西紅花酸類[13]等成分。氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素在人體生命過程中發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動的主要承擔(dān)者。氨基酸可以提高人體免疫力，維持正常代謝水平。部分氨基酸還可以發(fā)揮健腦、調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)生長和發(fā)育等作用。微量元素不僅是人體的必要組分，還充當(dāng)酶的激活劑、催化劑等角色。目前，西紅花花瓣中氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素等成分研究較少。本研究分別測定了西紅花花瓣中氨基酸、蛋白質(zhì)和微量元素的含量，為西紅花的綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

西紅花柱頭及花瓣樣品由上海優(yōu)耕農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，經(jīng)江蘇省藥品檢驗研究院胡浩彬主任藥師鑒定為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的柱頭及花瓣。將西紅花花瓣及殘留的柱頭經(jīng)冷凍干燥后，以挑選出殘剩柱頭的花瓣(挑選)和未經(jīng)挑選柱頭的花瓣(未挑選)作為研究樣品。

16種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)，批號：SLBT4982，濃度均為2.5 μmol·mL-1，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；多元素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液[硼(B)、鈦(Ti)、釩(V)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鋅(Zn)、砷(As)、硒(Se)、鍶(Sr)、鉬(Mo)、鎘(Cd)、錫(Sn)、銻(Sb)、鋇(Ba)、汞(Hg)、鉈(Tl)、鉛(Pb)，批號：GNM-M25748-2013(17D5090)，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1]、鉀(K)單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液(批號：GSB 04-1733-2004，質(zhì)量濃度：1000 μg·mL-1)均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鈉(Na)單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液[批號：GBW(E)080127，質(zhì)量濃度：1000 μg·mL-1]、鎂(Mg)單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液[批號：GBW(E)080126，質(zhì)量濃度：1000 μg·mL-1]、鋁(Al)單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液[批號：GBW(E)080219，質(zhì)量濃度：1000 μg·mL-1]、鈣(Ca)單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液[批號：GBW(E)080118，質(zhì)量濃度：1000 μg·mL-1]均購于中國計量科學(xué)研究院；內(nèi)標(biāo)多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[批號：IS7B17D1，其中含有鉍(Bi)、鎵(Ga)、銦(In)、鋰(Li)、鈧(Sc)、鋱(Tb)、釔(Y)，質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1，Reagecon公司]；生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-黃芪樣品[批號：GBW10028(GSB-19)，地球物理地球化學(xué)勘察研究所]；嬰兒配方乳粉中蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖定量分析質(zhì)控樣品(批號：QC-IP-709，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心)。

鹽酸(分析純)、雙氧水(優(yōu)級純)、硫酸鉀(分析純)、硫酸銅(分析純)、硫酸(分析純)、硼酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸(優(yōu)級純，德國Merck公司)；水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 儀器

L-8900型氨基酸分析儀(日立儀器有限公司)；7800型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，安捷倫科技有限公司)；Mars6型微波消解儀(美國CEM公司)；K-360型全自動凱氏定氮儀(瑞士Buchi有限公司)；AE-240型電子分析天平(精度為0.1 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 氨基酸的測定

2.1.1分析條件 磺酸型陽離子樹脂色譜柱，檢測波長分別為570、440 nm[14]。

2.1.2供試品溶液的制備 分別稱定研細(xì)混勻后的西紅花花瓣(挑選)、西紅花花瓣(未挑選)及西紅花柱頭約1 g，置耐壓螺蓋玻璃試管中，加入6 mol·L-1鹽酸溶液10 mL，置減壓干燥器中抽真空，充入氮氣，重復(fù)抽真空-充入氮氣3次后，在充氮狀態(tài)下擰緊螺絲蓋。將耐壓螺蓋玻璃試管放在110 ℃下水解22 h后，取出，冷卻至室溫。將水解液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用少量水潤洗試管3次，潤洗液移入同一量瓶內(nèi)，水定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液1 mL置15 mL離心管中，于45 ℃下氮氣吹干，殘渣用水溶解并定容于10 mL量瓶，搖勻，精密吸取3 mL置于10 mL量瓶，用水稀釋并定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，供測定。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取濃度均為2.5 μmol·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，定容至10 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品中間使用液。再精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品中間使用液0.25、0.50、1.50、2.00、2.50 mL分別置于5 mL量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.4方法學(xué)考察

2.1.4.1線性關(guān)系考察 分別將2.1.3項下標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液注入氨基酸分析儀，進(jìn)樣量20 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，氨基酸濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)以及線性范圍，線性關(guān)系良好，見表1。

表1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.4.2精密度試驗 取2.1.3項下對照品中間使用液，注入氨基酸分析儀，重復(fù)測定6次，進(jìn)樣量20 μL，計算各氨基酸峰面積的RSD。結(jié)果表明，Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg和Pro峰面積的RSD分別為0.26%、0.21%、0.15%、0.11%、0.19%、0.25%、0.30%、0.18%、0.24%、0.17%、0.28%、0.15%、0.13%、0.16%、0.24%和0.12%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3重復(fù)性試驗 取西紅花柱頭，按照2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，注入氨基酸分析儀，計算氨基酸含量及RSD，結(jié)果表明，Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg和Pro峰面積的RSD分別為2.31%、2.26%、3.09%、1.55%、3.16%、5.32%、4.57%、7.11%、4.13%、2.48%、4.49%、3.42%、6.74%、3.02%、3.91%和1.08%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.4.4加樣回收率試驗 取西紅花柱頭，稱取6份樣品，添加0.25 μmol·mL-1氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液一定體積，按照2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，加樣回收率為85.8%～97.8%，RSD為0.77%～4.52%，表明回收率和精密度符合要求。

2.1.5樣品氨基酸含量測定結(jié)果 按照2.1.2項下分別對西紅花花瓣(挑選)、西紅花花瓣(未挑選)及西紅花柱頭進(jìn)行氨基酸測定，見表2。從實驗數(shù)據(jù)可以看出三者氨基酸含量較為接近。

表2 西紅花花瓣與柱頭氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3) g·kg-1

2.2 元素測定

2.2.1ICP-MS測定條件 射頻功率1500 W；等離子體氣流量15 L·min-1；采樣錐：鎳；霧化室溫度：2 ℃；樣品提升速率：0.3 r·s-1；霧化器：同心霧化器；采集方式：跳峰；分析模式：碰撞反應(yīng)池[15]。

2.2.2供試品溶液的制備 稱取研細(xì)混勻樣品約0.25 g，置消解罐中，加入硝酸5 mL，進(jìn)行預(yù)消解，預(yù)消解完成后再加入雙氧水2 mL，置微波消解儀進(jìn)行消解，消解完成后冷卻，并進(jìn)行趕酸，趕酸完成后用純化水將消解液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，上機(jī)測定時再精密吸取上述樣品溶液1 mL置100 mL量瓶中，用純化水稀釋并定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜后上機(jī)測定。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液0.1 mL及Na、Mg、Al、K、Ca單元素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液各0.01 mL置于50 mL量瓶中，用5%硝酸稀釋并定容至刻度，搖勻，制成多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液。取上述多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液2.5 mL置50 mL量瓶中，用5%硝酸溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，制成多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用液(1)。準(zhǔn)確移取多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用液(1)5.0、2.0、1.0、0.5 mL置于10 mL量瓶中，用5%硝酸稀釋并定容至刻度，搖勻，制成多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用液(2)～(5)，作為系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.2.4內(nèi)標(biāo)多元素溶液配制 取內(nèi)標(biāo)多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL置于50 mL量瓶中，用5%硝酸溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，制成內(nèi)標(biāo)多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液。取內(nèi)標(biāo)多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液儲備液5 mL置于20 mL量瓶中，用5%硝酸稀釋并定容至刻度，搖勻，制成內(nèi)標(biāo)多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用液。Bi、Ga、In、Tb、Y質(zhì)量濃度均為10 ng·mL-1，Li、Sc質(zhì)量濃度均為50 ng·mL-1。

2.2.5空白溶液制備 除不稱定樣品外，其余同2.2.2項下制備空白樣品溶液。

2.2.6方法學(xué)考察

2.2.6.1線性關(guān)系考察 分別將上述多元素標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，以待測元素與內(nèi)標(biāo)元素信號強(qiáng)度的響應(yīng)比率為縱坐標(biāo)(Y)，元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程、r及線性范圍，線性關(guān)系良好。結(jié)果見表3。

表3 26種元素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.6.2精密度試驗 取2.2.3項下多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液使用液(3)，注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，重復(fù)測定11次，以待測元素與內(nèi)標(biāo)元素的信號強(qiáng)度的響應(yīng)比率計算RSD。結(jié)果表明，26種元素(B、Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、Hg、Tl和Pb)的RSD分別為4.64%、2.99%、3.06%、5.12%、4.82%、2.82%、4.77%、4.91%、4.36%、6.68%、4.52%、2.25%、2.36%、3.47%、3.93%、2.62%、3.93%、2.06%、3.82%、2.34%、3.60%、2.21%、3.44%、2.87%、4.45%、2.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.6.3加樣回收率試驗 取元素質(zhì)控樣，按照2.2.2項下方法平行制備2份供試品溶液，按2.2.1項下條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明，26種元素(B、Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、Hg、Tl和Pb)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為16.91、1 410.12、2 211.13、1 912.24、6 903.15、4 711.42、19.31、2.32、1.90、32.33、1 091.24、0.42、2.21、7.94、21.93、0.53、0.05、0、5.13、0.04、0、0.05、19.64、0.06、0.05、1.51 mg·kg-1，測得量與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值比較后，均在范圍內(nèi)，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度符合要求。

2.2.7樣品元素含量測定 按照參考文獻(xiàn)[15]方法，分別對挑選后的西紅花花瓣及柱頭中26種元素進(jìn)行測定。結(jié)果表明，3種試樣中元素含量由高到低順序為K、Mg、Fe、Al、Ca、Mn(表4)。

表4 西紅花花瓣和柱頭元素測定結(jié)果(n=3) mg·kg-1

2.3 蛋白質(zhì)測定

2.3.1檢測參數(shù) 自動凱氏定氮儀蒸汽輸出90%[16]。

2.3.2供試品溶液制備 取混勻的供試樣品，準(zhǔn)確稱定后，置凱氏定氮儀消化瓶中，加消化劑硫酸鉀6 g、硫酸銅0.4 g，再沿瓶壁緩緩加硫酸20 mL進(jìn)行消化，當(dāng)消化溫度達(dá)到420 ℃之后，繼續(xù)消化1 h，當(dāng)消化管內(nèi)容物的顏色逐漸轉(zhuǎn)化成透明的淡綠色時，取出冷卻后加入50 mL水，于自動凱氏定氮儀上實現(xiàn)自動加液、蒸餾、滴定、記錄滴定數(shù)據(jù)。同法檢測空白對照樣品。

2.3.3方法學(xué)考察

2.3.3.1重復(fù)性試驗 取西紅花柱頭，按照2.3.1項下方法平行制備6份供試品溶液，用自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定，計算蛋白質(zhì)含量及RSD，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為162.67～162.93 g·kg-1，RSD為0.05%，方法的重復(fù)性良好。

2.3.3.2加樣回收率試驗 取質(zhì)控樣品按照2.3.2項下方法平行制備2份供試品溶液，測定蛋白質(zhì)含量并與質(zhì)控樣品的標(biāo)準(zhǔn)值比較，測定值均值為239.02 g·kg-1，在質(zhì)控樣規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(233.90～250.00 g·kg-1)，結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度符合要求。

2.3.4樣品蛋白質(zhì)含量測定 分別稱取西紅花花瓣(挑選)、西紅花花瓣(未挑選)及西紅花柱頭約0.5 g，按照2.3.2項下制備樣品，進(jìn)行樣品測定(n=3)。結(jié)果表明，西紅花花瓣(挑選)、西紅花花瓣(未挑選)及西紅花柱頭蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為117.15、137.78、162.90 g·kg-1。

3 討論

挑選、未挑選西紅花花瓣和西紅花柱頭的氨基酸、微量元素和蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果顯示，樣品中均含有6種人體所需的必需氨基酸(Thr、Val、Ile、Leu、Phe、Lys)，必需氨基酸的含量分別占總氨基酸含量的38.0%、35.5%、39.5%。西紅花花瓣中還含有大量的Glu。文獻(xiàn)報道，Glu是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要用于治療肝性昏迷，還可改善兒童智力發(fā)育，可作為篩查智商正常的高功能孤獨癥兒童的診斷指標(biāo)[17]。西紅花花瓣含有人體所必需的6種微量元素(Cr、Fe、Co、Cu、Mo、Zn)，未檢測到對人體有潛在危害的重金屬元素Sn和Hg，并且As、Cu、Cd、Pb的含量也都符合《中華人民共和國藥典》2020年版重金屬限量的規(guī)定。同時西紅花花瓣還富含大量的K，含量高于西紅花柱頭，約占總微量元素的84.5%。K為人體必需的礦物質(zhì)元素之一，主要分布在人體細(xì)胞內(nèi)，維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓和細(xì)胞內(nèi)外的酸堿平衡。人體缺鉀后，容易產(chǎn)生心肌損害，引起細(xì)胞變性和壞死，此外還會對腎、腸和骨骼造成一定的損傷[18]。除此之外，西紅花花瓣中蛋白質(zhì)含量雖低于西紅花柱頭，但種類也較豐富。

檢測數(shù)據(jù)證實，西紅花花瓣含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以在保健食品方面對其進(jìn)行開發(fā)和研究，并通過動物實驗和臨床研究對其進(jìn)行深入研究，提高其利用價值。雖然西紅花花瓣有些營養(yǎng)成分的含量低于柱頭，但是在1朵西紅花中，柱頭僅占很小的一部分。我國上海崇明的西紅花種植已達(dá)上千畝，農(nóng)戶在采摘柱頭后，其主要副產(chǎn)物花瓣都被丟棄，有些柱頭還殘剩在花瓣上，造成了嚴(yán)重的資源浪費。若將這些西紅花花瓣合理利用，將會對西紅花柱頭的短缺起到一定的緩解作用，同時也會降低種植成本、增加農(nóng)戶收益、促進(jìn)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展、減少環(huán)境污染。