唐秀松，陳靜，方剛，黃安，陳煒

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西壯醫(yī)應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點(diǎn)應(yīng)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

失眠(insomnia)是睡眠障礙中的一種常見類型，主要表現(xiàn)為入睡困難、睡眠維持障礙、早醒、睡眠質(zhì)量下降和總睡眠時間減少，同時伴日間功能障礙。失眠具有高患病率、高復(fù)發(fā)率、病情反復(fù)難愈等特點(diǎn)[1]。長期失眠不僅會影響人們正常的工作和生活，還會增加罹患各種疾病的風(fēng)險，甚至可能引發(fā)惡性意外事故。目前臨床治療失眠藥物主要包括苯二氮卓類受體激動劑、褪黑素受體激動劑、食欲素受體拮抗劑和具有催眠效應(yīng)的抗抑郁藥物。其中以苯二氮卓類為主，該類藥物起效快，能幫助患者快速入睡，但其具有成癮性、撤藥困難、不良反應(yīng)大、遠(yuǎn)期效果不顯著等不足。非藥物治療方法有睡眠教育、認(rèn)知治療、行為治療、音樂治療等[2]。自古以來，中醫(yī)學(xué)對于失眠的治療具有專方專藥，如酸棗仁湯、黃連阿膠湯、交泰丸等。在結(jié)合辨證論治、三因制宜的基礎(chǔ)上，開立的處方往往能取得不錯的療效，并且具有不良反應(yīng)小、停藥容易、療效穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

柴胡疏肝散記載于《景岳全書·古方八陣·散陣》[3]，該方由柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草組成，具有奏疏肝行氣、活血止痛之功，常用于治療肝郁氣滯的病癥，如慢性肝炎和胃炎、肋間神經(jīng)痛、失眠、焦慮抑郁癥、斑禿、婦科和男科疾病等[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，柴胡疏肝散能上調(diào)圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證大鼠、阿爾茨海默病大鼠和抑郁模型大鼠海馬組織的5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺水平，改善學(xué)習(xí)記憶能力和抑郁狀態(tài)[5-7]；上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體酪氨酸激酶受體B mRNA水平[8]；增加肝郁大鼠海馬磷酸二酯酶-4及其亞型的mRNA的表達(dá)[9]；調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[包括下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、下丘腦-垂體-甲狀腺素(HPT)軸、下丘腦-垂體-卵巢(HPO)軸][10-12]；提高免疫力[13-15]；抗氧化[16-17]等。大量臨床研究表明[18-24]，單獨(dú)的柴胡疏肝散或柴胡疏肝散聯(lián)合其他藥物治療肝郁氣滯型的失眠療效顯著，但未明確指出該方治療失眠的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要以“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)為特征，其系統(tǒng)性的研究與中醫(yī)學(xué)的“整體觀念”一致[25]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，深入探討該方治療失眠的作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用及后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 柴胡疏肝散藥物有效成分的篩選及相關(guān)靶點(diǎn)的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別輸入柴胡疏肝散中7味中藥名稱，即柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草，搜索7味中藥有效成分，通過口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選。同時在TCMSP平臺Relate Targets欄目中直接收集柴胡疏肝散中7味中藥的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 柴胡疏肝散靶點(diǎn)基因注釋

應(yīng)用UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot. org/)和Perl 5.26.3軟件(https：//www.perl.org/get.html)對獲取的柴胡疏肝散所有相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行注釋，獲得柴胡疏肝散對應(yīng)的相關(guān)基因，以備后序分析。

1.3 失眠相關(guān)疾病靶點(diǎn)獲取

以“insomnia”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//genealacart.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)進(jìn)行檢索，并下載失眠的疾病靶點(diǎn)，綜合后去除其中的重復(fù)靶點(diǎn)，最終得到失眠疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 繪制韋恩圖

運(yùn)用R 3.6.3軟件(https：//www.r-project.org/)中的VennDiagram程序包對獲得的柴胡疏肝散藥物靶點(diǎn)和失眠疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析處理，最終得到藥物與疾病之間的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2軟件(https：//cytoscape.org/)對所獲得的柴胡疏肝散有效成分、交集靶點(diǎn)進(jìn)行計算分析，構(gòu)建柴胡疏肝散有效成分-失眠調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將柴胡疏肝散與失眠的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0(https：//string-db.org/)網(wǎng)站，限定研究物種為“Homo sapiens”，將網(wǎng)絡(luò)中無關(guān)或游離蛋白去掉，余參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)定值，最終得到柴胡疏肝散治療失眠的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.7 PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白生物功能注釋分析

將獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心蛋白導(dǎo)入功能注釋(functional annotation)工具DAVID(https：//david. ncifcrf. gov/)，限定研究物種為人類(Homo sapiens)，選擇基因本體(GO)分析下的分子功能(MF)、生物過程(BP)和細(xì)胞組成(CC)部分進(jìn)行GO富集分析，選擇Pathway分析中京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析，設(shè)定P<0.01，進(jìn)一步尋找有效成分靶點(diǎn)顯著富集的主要功能與體內(nèi)通路，最后利用Cytoscape 3.7.2軟件clue GO插件繪制條形圖展示富集結(jié)果。

1.8 KEGG-PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用KEGG數(shù)據(jù)庫中的KEGG Mapper工具，將前述方法所得的核心蛋白對應(yīng)的UniProt ID導(dǎo)入其中，并限定研究物種為“Homo spiens”，獲得柴胡疏肝散治療失眠的作用通路，篩選與上述靶點(diǎn)有關(guān)的通路，整合得到最終的通路。并利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建KEGG-PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 柴胡疏肝散活性成分篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，共得到柴胡疏肝散157個有效成分，8488個潛在靶點(diǎn)，去除重復(fù)的靶點(diǎn)后共獲得240個藥物相關(guān)靶點(diǎn)。因柴胡疏肝散有效成分較多，只展示OB≥60%的活性成分(表1)。

表1 柴胡疏肝散活性成分(OB≥60%)

續(xù)表1

2.2 失眠疾病靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中搜集到失眠的疾病靶點(diǎn)有2280個，在OMIM中得到失眠的疾病靶點(diǎn)3個。通過R軟件分析柴胡疏肝散藥物靶點(diǎn)240個與失眠疾病靶點(diǎn)2283個，得到藥物-疾病共同靶點(diǎn)91個，繪制韋恩圖(圖1)。

圖1 柴胡疏肝散與失眠交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行計算分析，得到柴胡疏肝散有效成分-失眠疾病靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。

注：正方形代表藥物有效成分，其中綠色為柴胡，灰色為陳皮，深紫色為甘草，深藍(lán)色為白芍，淺綠色為香附，紫色為枳殼，黃色為共有的成分；棕色三角形代表柴胡疏肝散與失眠的91個交集基因。圖2 柴胡疏肝散治療失眠的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過借助STRING在線網(wǎng)站，按照網(wǎng)站默認(rèn)設(shè)置參數(shù)值，對柴胡疏肝散與失眠的交集靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。其中作用強(qiáng)度排名前30位的核心靶點(diǎn)見圖4，包括白細(xì)胞介素-6(IL-6)、蛋白激酶B1(Akt1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、Fos、過氧化氫酶(CAT)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)等。

圖3 柴胡疏肝散-失眠PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 柴胡疏肝散-失眠PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)

2.5 GO富集分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示，BP、CC和MF相關(guān)條目分別為1624、62、97條。根據(jù)P值排序，每個模塊展示前20位的條目(圖5)。其中BP主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對金屬離子的響應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、應(yīng)答輻射、對抗生素的反應(yīng)等。CC主要包括突觸后膜的組成成分、突觸后膜固有成分、突觸膜的組成成分、突觸膜內(nèi)成分、突觸前膜的組成成分、脂筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、突觸前膜固有成分、突觸前膜等。MF主要集中在腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、銨離子結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、多巴胺結(jié)合、細(xì)胞因子活性等。

圖5 柴胡疏肝散-失眠PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白GO功能分析

2.6 KEGG富集分析

KEGG通路富集分析得到103條通路，主要包括糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、前列腺癌通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、內(nèi)分泌抵抗通路、多巴胺能突觸、IL-17信號通路、催乳素信號通路等。根據(jù)P值大小，排列前20位的通路見圖6。

圖6 柴胡疏肝散-失眠PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白KEGG功能富集分析

2.7 KEGG-PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白關(guān)系

KEGG-PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(圖7、表2)中包括20條通路和富集在這些通路上的55個蛋白。從圖中可知，與IL-6、Akt1、MAPK14、VEGFA、Fos等靶點(diǎn)相連的通路較多。hsa04933、hsa05418、hsa04668、hsa05167等通路上相關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)較多。

注：紫色橢圓形表示通路；黃色三角形表示靶點(diǎn)；圖形越大，說明鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多。圖7 KEGG-PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

表2 KEGG-PPI網(wǎng)絡(luò)核心蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)信息

3 討論

失眠在中醫(yī)屬于“不寐”“不得眠”“目不瞑”“不得臥”等范疇，病位在心，與肝脾腎相關(guān)，基本病機(jī)為陽不入陰。失眠的病因很多，涉及肝陽擾動、思慮過度、內(nèi)傷心脾、陽不交陰、陰虛火旺、心腎不交等[26]。醫(yī)者常四診合參，進(jìn)行辨證施治。

柴胡疏肝散由柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草7味藥組成。君藥柴胡主要化學(xué)成分柴胡皂苷具有鎮(zhèn)靜、解熱、提高免疫、抗炎、抗病毒、護(hù)肝、抗腫瘤等作用[27]。柴胡皂苷能夠使貓的慢波睡眠Ⅱ期和快動眼睡眠期顯著增加，睡眠時間延長[28-30]。白芍提取物白芍總苷可延長正常大鼠慢波睡眠的持續(xù)時間，使失眠大鼠的睡眠參數(shù)恢復(fù)正常[31]。文獻(xiàn)報道，香附揮發(fā)油對促硝西泮、苯二氮類藥物有明顯的促透皮作用[32-33]。香附揮發(fā)油可能是通過平衡中樞膽堿能系統(tǒng)上調(diào)5-羥色胺水平，改善焦慮小鼠的癥狀[34]。枳殼提取物具有抗抑郁的作用[35-36]。炙甘草中含有較多的甘草總黃酮、甘草苷，常被用于抑郁癥的治療[37]。甘草黃酮提取物可通過抑制皮質(zhì)醇升高、調(diào)節(jié)HPA軸起到預(yù)防和治療抑郁癥[38]。該方各藥均對睡眠有一定的改善作用。

柴胡疏肝散治療失眠的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示，IL-6、Akt1、VEGFA、Fos、CAT可能為柴胡疏肝散治療失眠的核心靶點(diǎn)。研究表明，失眠與炎性因子表達(dá)上升密切相關(guān)，當(dāng)人體睡眠被剝奪后，炎性反應(yīng)因子水平直線增高[39]。增高的時間以下午至睡前明顯，其中IL-6的水平與睡眠覺醒時間呈正比，與非快速眼動相睡眠和睡眠質(zhì)量呈反比[40]。作為炎癥反應(yīng)根源的白細(xì)胞介素類細(xì)胞因子會造成越來越多的炎性介質(zhì)釋放，破壞正常的睡眠節(jié)律，最終出現(xiàn)失眠[41]。而且由細(xì)胞因子組成的神經(jīng)遞質(zhì)免疫系統(tǒng)可通過擾亂血液、神經(jīng)等的正常狀態(tài)，進(jìn)而影響睡眠質(zhì)量[42]。睡眠障礙的治療效果及預(yù)后的評估可通過監(jiān)測血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平，這些因子會通過不同途徑影響睡眠進(jìn)程[43]。應(yīng)用疏肝解郁法治療肝郁型圍絕經(jīng)期失眠女性患者，結(jié)果表明，治療后患者的IL-6水平下調(diào)，睡眠質(zhì)量提高[44]。肝郁分級與Akt蛋白及mRNA水平呈中度正相關(guān)，圍絕經(jīng)期婦女非器質(zhì)性失眠可能是由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路介導(dǎo)的，應(yīng)用PI3K/Akt信號通路抑制劑治療是該類疾病今后研究的方向[45]。VEGFA基因在致死性家族失眠癥(FFI)患者腦組織基因表達(dá)譜中是上調(diào)的基因[46]。Fos又稱c-Fos，是一種原癌基因，參與細(xì)胞生長、分化、信息傳遞及動物的學(xué)習(xí)和記憶和維持的清醒。褪黑素能有效調(diào)節(jié)大鼠的晝夜節(jié)律，改善睡眠質(zhì)量[47-48]。哺乳動物視交叉上核中c-Fos基因的表達(dá)水平與年齡呈負(fù)相關(guān)，可反映睡眠質(zhì)量和晝夜節(jié)律，是晝夜節(jié)律的關(guān)鍵基因，睡眠被剝奪后c-Fos基因表達(dá)會增加[49-52]。

PPI結(jié)果顯示，柴胡疏肝散抗失眠的關(guān)鍵蛋白包括IL-6、Akt1、VEGFA、Fos、CAT、CREB1等，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、突觸膜的組成成分、突觸膜內(nèi)成分、突觸前膜的組成成分、脂筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、銨離子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、多巴胺結(jié)合、細(xì)胞因子活性等生物學(xué)過程，參與AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、TNF信號通路、前列腺癌通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、內(nèi)分泌抵抗通路、多巴胺能突觸通路、IL-17信號通路、催乳素信號通路等的調(diào)控。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討柴胡疏肝散治療失眠的作用機(jī)制，從整體上分析柴胡疏肝散和失眠的關(guān)系，為柴胡疏肝散相關(guān)的分子生物學(xué)研究及更深入的藥理學(xué)探索提供了參考。但本研究未能對各味中藥的劑量加以考慮，這將是以后網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及相關(guān)研究需要關(guān)注的問題。