鄧艷，時(shí)悅，肖洪賀，李妍，陳吉聰，李婉嫕，楊靜嫻

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病，以β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的炎性老年斑(SP)和tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)及腦內(nèi)神經(jīng)元丟失為主要病理特征。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，主要有Aβ沉積、tau過(guò)度磷酸化、膽堿能突觸功能損傷、氧化應(yīng)激、炎癥損傷和鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、神經(jīng)元死亡等學(xué)說(shuō)[1]。其中，以Aβ沉積學(xué)說(shuō)最為公認(rèn)。Aβ最主要的組成為Aβ1-40和Aβ1-42，而Aβ1-42更容易聚集成寡聚體，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性較強(qiáng)，能夠直接導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[2]。AD病因的復(fù)雜性和多因素性為其治療提出了挑戰(zhàn)。目前，西醫(yī)尚無(wú)法完全治愈AD，只能以緩解癥狀為主。因此，最緊要的問(wèn)題是尋找從根本上治療AD的新方法[3]。中醫(yī)中藥的應(yīng)用從整體觀念出發(fā)，將研究思路從單體成分及單個(gè)靶點(diǎn)治療調(diào)整為整體探究、系統(tǒng)調(diào)節(jié)的方式[4]，通過(guò)多靶點(diǎn)間的相互作用實(shí)現(xiàn)增效減毒的效果[5]，這與AD發(fā)病的復(fù)雜病理生理機(jī)制相符合。

近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)技術(shù)在多種疾病中得到應(yīng)用，在AD的治療中也有廣闊的應(yīng)用前景[6]。NSCs是一種具有自我更新能力的多潛能細(xì)胞，能夠分化出各種類型的神經(jīng)細(xì)胞，參與到神經(jīng)再生過(guò)程中。神經(jīng)再生過(guò)程主要包括4個(gè)階段，即：1)NSCs存活、增殖和分化；2)新生神經(jīng)元的成熟；3)突觸形成；4)神經(jīng)回路整合。AD患者隨著年齡增長(zhǎng)，腦中的神經(jīng)再生能力逐漸下降，同時(shí)Aβ能顯著抑制NSCs的增殖和遷移能力[7-8]，所以在病理情況初期保護(hù)NSCs免受損傷、促進(jìn)NSCs增殖及分化尤為重要。

開(kāi)心散是治療健忘的經(jīng)典名方，在2018年4月被國(guó)家中醫(yī)藥管理局會(huì)同國(guó)家藥品監(jiān)督管理局制定的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》收錄。開(kāi)心散由人參、遠(yuǎn)志、石菖蒲和茯苓4味藥組成，具有益氣補(bǔ)虛、安神定驚、益智、交通心腎的作用。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，干細(xì)胞與“腎精”具有同一性，被認(rèn)為是腎精在細(xì)胞層面的體現(xiàn)[9-10]。開(kāi)心散補(bǔ)腎益精的功效可激發(fā)臟腑潛在的機(jī)能，即激活并促進(jìn)NSCs增殖與分化，起到修復(fù)再生AD受損組織、恢復(fù)功能的作用。開(kāi)心散可促進(jìn)小鼠長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)形成，調(diào)節(jié)突觸后密度蛋白-95(PSD-95)的表達(dá)，增強(qiáng)突觸可塑性[11]；能夠調(diào)控炎癥因子Bcl-2及Bax的表達(dá)[12]；可以通過(guò)激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴的信號(hào)通路，使神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)增加，進(jìn)而上調(diào)突觸素的表達(dá)[13]；還作用于膽堿能系統(tǒng)，降低乙酰膽堿酯酶、活性氧、丙二醛的水平和活性[14]。利用Aβ造模的小鼠，在造模前7 d給予開(kāi)心散后，能增加突觸前膜Synapsin 1磷酸化，改善Aβ誘發(fā)的小鼠記憶障礙[15]。所以，開(kāi)心散治療神經(jīng)退行性疾病具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本研究采用Aβ1-42寡聚體孵育NSCs制備AD細(xì)胞模型，模擬AD患者腦內(nèi)NSCs，探討開(kāi)心散含藥血清對(duì)病理狀態(tài)下NSCs增殖和分化能力的影響，為開(kāi)心散治療AD提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(遼)2017-0001。小鼠一雄一雌合籠，飼養(yǎng)于20～25 ℃環(huán)境，自由飲食和飲水，每日光照12 h。將孕鼠單獨(dú)一籠飼養(yǎng)直至生產(chǎn)，取48 h內(nèi)新生乳鼠用于實(shí)驗(yàn)。研究中所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)操作都經(jīng)過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)并嚴(yán)格按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)倫理行為準(zhǔn)則實(shí)行，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)為SYXK(遼)2019-0004。

1.2 試藥

人參PanaxginsengC.A.Meyer(江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片公司)；遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld(安徽石田中藥飲片有限公司)；茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf(安國(guó)市安興中藥飲片有限公司)；石菖蒲AcortwtatarinowiiSchott(安國(guó)市輝發(fā)中藥飲片加工有限公司)均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊靜嫻教授鑒定為正品。DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，25%胰蛋白酶，青-鏈雙抗(Gbico公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)；CyTM3標(biāo)記羊抗鼠二抗(Jackson公司)；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)購(gòu)自PeproTech公司；硫酸軟骨素蛋白多糖2(NG2)抗體(Upstate公司)；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、Ki67抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；中分子量神經(jīng)絲蛋白(NF-M)抗體(StemCell公司)；巢蛋白(Nestin)抗體(Millipore公司)；Aβ1-42(南京肽業(yè)生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司)。

1.3 儀器

Ti-S型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器公司)；UV-5600型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海元析公司)。

2 方法

2.1 開(kāi)心散含藥血清的制備

《千金要方》中記載開(kāi)心散組成為“遠(yuǎn)志、人參各四分，茯苓二兩，菖蒲一兩”[16]。取人參、遠(yuǎn)志、茯苓、石菖蒲飲片，粉碎，過(guò)60目篩，按1∶1∶50∶25(共200 g)制備開(kāi)心散[17]，加入10倍量純凈水，浸泡過(guò)夜，回流提取2 h，濾過(guò)；再加入8倍量純凈水，繼續(xù)回流提取2 h，濾過(guò)；合并2次濾液，減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度為4.8 g·mL-1，于-20 ℃凍存，備用。

依據(jù)體表面積換算法[18]，將成人每日所需生藥量換算成小鼠所需藥量。60 kg的成人每日需開(kāi)心散114.88 g，換算成20 g小鼠每日所需生藥量為0.480 5 g，作為開(kāi)心散中劑量組。將6月齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別灌胃給予0.9%氯化鈉溶液和開(kāi)心散48、24、12 g·kg-1(以生藥量計(jì))，每天1次，連續(xù)7 d[19]。末次給藥2 h后，小鼠眼眶采血，室溫靜置30 min，3000 r·min-1離心15 min(離心半徑為3.5 cm)，取上層血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，分裝，制得高、中、低劑量開(kāi)心散含藥血清，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 Aβ1-42寡聚體的制備

Aβ1-42粉末加入六氟異丙醇，溶解，揮干，加入含有1%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM/F12，使其濃度為200 μmol·L-1，4 ℃下孵育24 h，制得終濃度為200 μmol·L-1的Aβ1-42寡聚體，24 h內(nèi)使用[20]。

2.3 NSCs的體外培養(yǎng)與鑒定

取48 h內(nèi)新生乳鼠海馬，剪碎，加入0.125%胰酶，消化15 min，反復(fù)吹打后，過(guò)70 μm篩網(wǎng)，得到含有NSCs的單細(xì)胞混懸液，離心后，加入增殖培養(yǎng)基復(fù)懸，以2×106個(gè)/mL密度接種于24孔板內(nèi)，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d半量換液，培養(yǎng)7～10 d傳代[21]。取第3代的NSCs以2×105個(gè)/mL的密度重新接種于96孔板內(nèi)，采用免疫熒光法(IF)鑒定培養(yǎng)NSCs的Nestin表達(dá)情況。

2.4 CCK-8法檢測(cè)NSCs的存活

將機(jī)械性吹打后的NSCs以2×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，分為對(duì)照組、模型組及開(kāi)心散含藥血清高(KXS-H)、中(KXS-M)、低(KXS-L)劑量組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。對(duì)照組和模型組給予10%空白血清，各給藥組分別對(duì)應(yīng)給予10%的開(kāi)心散含藥血清[22]。給藥24 h后，加入Aβ1-42使其終濃度為20 μmol·L-1，孵育24 h，參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，設(shè)立只含培養(yǎng)液的空白組，各組培養(yǎng)孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(A)值，根據(jù)公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×
100%

(1)

2.5 NSCs增殖能力檢測(cè)

2.5.1NSCs直徑測(cè)量 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、KXS(給予10%開(kāi)心散含藥血清中劑量)組，給藥及Aβ1-42孵育同2.4項(xiàng)下。孵育24 h后，將各組NSCs機(jī)械性吹打?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞，并在增殖培養(yǎng)基內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)7 d，分別在第三、五、七天拍照記錄，采用Image J軟件進(jìn)行神經(jīng)球計(jì)數(shù)和直徑測(cè)量。每組進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，每組取10個(gè)神經(jīng)球測(cè)量直徑。

2.5.2IF檢測(cè)Ki67蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組及處理同2.5.1項(xiàng)下，選用培養(yǎng)至第三天的神經(jīng)干細(xì)胞，用IF法檢測(cè)Ki67蛋白表達(dá)情況。將培養(yǎng)于96孔板中的各組細(xì)胞用4%多聚甲醛常溫固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；1%Triton X-100透化10 min，PBS清洗3次；加5%BSA溶液封閉后PBS洗滌；每孔滴加用1%BSA稀釋的Ki67一抗(1∶150)4 ℃孵育過(guò)夜，次晨用PBS清洗；加入CyTM3標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶200)室溫避光孵育1 h，PBS緩沖液洗3次；DAPI染色液復(fù)染，PBS清洗，滴加少量防熒光淬滅劑，使用熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄，采用Image J對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.6 IF檢測(cè)NSCs的分化能力

取第3代NSCs，細(xì)胞分組及處理同2.5.1項(xiàng)下。細(xì)胞打散后接種于分化培養(yǎng)基(含有10% FBS和1% P/S的DMEM/F12)中誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)14 d，用IF法檢測(cè)其分化情況。4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗，0.5%Triton X-100透化15 min，PBS清洗，5%FBS封閉30 min，分別加入用1%BSA稀釋的NF-M(1∶100)、GFAP(1∶100)、NG2(1∶100)和Nestin(1∶100)一抗，4 ℃過(guò)夜，PBS清洗，加入CyTM3標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶200)，室溫孵育1.5 h，DAPI染液復(fù)染5 min，滴加少量防熒光淬滅劑，熒光倒置顯微鏡下(200×)觀察。每組進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，每孔隨機(jī)取3個(gè)視野，進(jìn)行采用Image J統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 NSCs的體外培養(yǎng)與鑒定

原代培養(yǎng)的NSCs呈懸浮細(xì)胞球，折光性強(qiáng)，單個(gè)存在。經(jīng)IF鑒定神經(jīng)球表達(dá)Nestin蛋白，且陽(yáng)性率達(dá)90%以上，證明其具有良好的NSCs特性(圖1)。

圖1 NSCs的培養(yǎng)與IF鑒定

3.2 開(kāi)心散含藥血清對(duì)NSCs存活率的影響

CCK-8結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組NSCs存活率顯著降低[(52.23±4.84)%，P<0.01]。KXS-H、KXS-M、KXS-L組細(xì)胞存活率分別為(85.2±9.61)%、(83.47±9.05)%、(80.17±4.09)%，與模型組比較，細(xì)胞存活率均顯著增高(P<0.01)。說(shuō)明開(kāi)心散含藥血清可以提高NSCs存活率，其中KXS-H組效果最好。但KXS-M組與KXS-H組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以最終選擇開(kāi)心散中劑量含藥血清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究(圖2)。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 開(kāi)心散不同劑量含藥血清對(duì)AD模型的NSCs存活能力的影響

3.3 開(kāi)心散含藥血清對(duì)NSCs增殖的影響

如圖3A～B所示，與對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)球直徑較小。與模型組比較，KXS組神經(jīng)球直徑顯著增加[(93.25±2.92)μm，P<0.01]。如圖3C～D所示，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Ki67蛋白陽(yáng)性率顯著降低[(32.87±4.01)%，P<0.01]；與模型組比較，KXS組細(xì)胞的Ki67蛋白陽(yáng)性率明顯升高[(48.55±1.94)%，P<0.01]。2種檢測(cè)方法說(shuō)明，在增殖培養(yǎng)基中，開(kāi)心散含藥血清能明顯促進(jìn)NSCs的增殖能力。

注：A.第七天各組細(xì)胞神經(jīng)球光鏡圖；B.各組細(xì)胞在第三、五、七天的神經(jīng)球直徑；C.第三天各組細(xì)胞Ki67蛋白陽(yáng)性表達(dá)；D.各組細(xì)胞Ki67蛋白陽(yáng)性率；與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 開(kāi)心散含藥血清對(duì)AD模型的NSCs增殖能力的影響

3.4 開(kāi)心散含藥血清對(duì)NSCs分化的影響

IF結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組NSCs向神經(jīng)元[(24.38±2.00)%，P<0.05]和少突膠質(zhì)細(xì)胞[(20.26±1.06)%，P<0.01]分化比例降低。與模型組比較，KXS組NSCs分化為神經(jīng)元[(31.95±0.58)%，P<0.05]的比例升高，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞[(31.32±3.04)%，P<0.05]的比例降低，而對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)顯著影響。3組細(xì)胞仍有少部分保持未分化狀態(tài)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在分化培養(yǎng)基中，開(kāi)心散含藥血清能夠拮抗Aβ誘導(dǎo)的NSCs向神經(jīng)元分化減少、向膠質(zhì)細(xì)胞分化增多的異常行為(圖4)。

注：A.第十四天NSCs分化不同類型神經(jīng)細(xì)胞，NF-M+神經(jīng)元、GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞、NG2+少突膠質(zhì)細(xì)胞和Nestin+未分化NSCs均為紅色，DAPI染細(xì)胞核為藍(lán)色；B.NSCs分化成各個(gè)類型細(xì)胞的定量分析；C.第十四天各組NSCs向神經(jīng)元分化；D.各組NSCs分化為神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞率；與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖4 開(kāi)心散含藥血清對(duì)AD模型的NSCs分化能力的影響

4 討論

Aβ作為極強(qiáng)的神經(jīng)毒性物質(zhì)，代謝異常會(huì)大量累積于神經(jīng)系統(tǒng)，可能是AD發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)因素[23]。研究表明，Aβ1-42可致海馬區(qū)NSCs增殖水平降低，損傷后引起明顯認(rèn)知功能障礙[24]；Aβ積聚會(huì)抑制神經(jīng)干/祖細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元分化，從而影響體外和體內(nèi)成年海馬的神經(jīng)發(fā)生[25]；Aβ通過(guò)破壞NSCs自我更新的線粒體信號(hào)，使NSCs的活性及增殖能力受到損害，并間接阻斷了神經(jīng)源性分化[26]。目前針對(duì)AD的治療策略都不能從根本上補(bǔ)充AD發(fā)病過(guò)程中丟失的神經(jīng)元。

NSCs在AD的治療中有廣泛的應(yīng)用前景，NSCs與其他成體細(xì)胞的區(qū)別在于其具有分化成多種不同類型細(xì)胞的能力，其可經(jīng)歷對(duì)稱或不對(duì)稱分裂成為2個(gè)子細(xì)胞。對(duì)稱分裂產(chǎn)生2個(gè)NSCs，而不對(duì)稱分裂產(chǎn)生1個(gè)NSCs和1個(gè)走向分化方向的細(xì)胞，分化的方向主要是神經(jīng)元、星形及少突膠質(zhì)細(xì)胞[27]。所以NSCs可以在生長(zhǎng)過(guò)程中分化成不同的神經(jīng)細(xì)胞，并且可以源源不斷的產(chǎn)生新的NSCs，且不會(huì)使之耗竭。

研究發(fā)現(xiàn)，開(kāi)心散含藥血清可以保護(hù)PC12細(xì)胞[28]；通過(guò)維持線粒體正常功能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[29]。目前已有的對(duì)于開(kāi)心散的研究大多是從改善AD小鼠記憶、激活通路改善突觸、炎癥因子的調(diào)節(jié)等角度進(jìn)行，但未見(jiàn)開(kāi)心散含藥血清能否促進(jìn)NSCs的增殖和分化繼而從根源上解決AD大量損傷及丟失的神經(jīng)細(xì)胞的研究。

本實(shí)驗(yàn)首先在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)NSCs，檢測(cè)NSCs的存活及增殖能力，然后在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)NSCs分化。Aβ1-42造模后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，Aβ1-42損傷的NSCs存活率降低，說(shuō)明符合AD細(xì)胞模型特征。與模型組比較，開(kāi)心散高、中、低劑量含藥血清組細(xì)胞存活率都提高。說(shuō)明開(kāi)心散含藥血清可以提高AD神經(jīng)干細(xì)胞存活率，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

通過(guò)Image J測(cè)量神經(jīng)球直徑可知，與模型組比較，開(kāi)心散含藥血清能夠使神經(jīng)球直徑顯著增加。IF檢測(cè)結(jié)果顯示，開(kāi)心散含藥血清使NSCs的Ki67陽(yáng)性率升高。說(shuō)明開(kāi)心散含藥血清能夠促進(jìn)AD神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。

在分化培養(yǎng)基中，與模型組比較，開(kāi)心散含藥血清促神經(jīng)干細(xì)胞分化為更多的神經(jīng)元和更少的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)影響。說(shuō)明開(kāi)心散含藥血清能夠拮抗Aβ1-42誘導(dǎo)的NSCs神經(jīng)元分化較少而膠質(zhì)細(xì)胞分化增強(qiáng)的異常行為。

本研究結(jié)果表明，開(kāi)心散含藥血清能提高Aβ1-42損傷的NSCs存活率，促進(jìn)其增殖，并拮抗Aβ1-42導(dǎo)致的NSCs神經(jīng)元分化較少而膠質(zhì)細(xì)胞分化增強(qiáng)，提示開(kāi)心散具有使NSCs向有利于機(jī)體神經(jīng)修復(fù)的方向發(fā)展的作用。開(kāi)心散對(duì)AD模型NSCs保護(hù)作用的作用機(jī)制將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)研究。