李衛(wèi)萍，姚宇，溫春梅，郭佳琪，郭寶林

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

紫蘇葉來源于唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的葉，揮發(fā)油是其發(fā)揮功效的主要成分[1]。目前，多采用提取獲得的揮發(fā)油研究紫蘇葉揮發(fā)油含量及組分受采收時間、采收部位、栽培條件等因素影響的情況[1-3]，而從紫蘇產(chǎn)生揮發(fā)油的器官開展研究將獲得更為直接的信息。已有研究報道，唇形科植物的揮發(fā)油由植物地上部分表皮腺毛合成和分泌[4-5]，紫蘇葉中腺毛分為頭狀腺毛和盾狀腺毛[6-8]。本研究對紫蘇葉表皮腺毛類型、分布、產(chǎn)生和貯藏?fù)]發(fā)油的功能進(jìn)行研究，以期建立腺毛種類、數(shù)量、分泌揮發(fā)油的情況與紫蘇揮發(fā)油含量的關(guān)系，從而進(jìn)行紫蘇種質(zhì)揮發(fā)油評價，為紫蘇良種選育提供參考。

1 材料

1.1 樣品

3份紫蘇分別來源于日本(RB-1)、中國河北(AGZ-12)和浙江(ZhJ-2Y2Z)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.。將3份紫蘇種植于北京市海淀區(qū)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所南園實驗田。采集5個不同發(fā)育階段的葉片，分別為未展開葉(位于莖尖)、幼葉Ⅰ(第一莖節(jié)上幼葉，葉面積約為成熟葉的1/20)；幼葉Ⅱ(第二、三節(jié)莖節(jié)上幼葉，葉面積約為成熟葉的1/4)；成熟葉Ⅰ(第四莖節(jié)成熟葉剛完全展開)；成熟葉Ⅱ(第十莖節(jié)上成熟葉，已開始衰老)[9]。

1.2 儀器

DM2599型光學(xué)顯微鏡(德國Leica 公司)。

1.3 試藥

熱離析液(30% H2O2-冰醋酸=1∶1)；醋酸甘油(50%冰醋酸-甘油-蒸餾水=1∶1∶1)；1，4-對亞硝基苯酚(色譜純，東京化成工業(yè)株式會社)；2，4-二硝基苯肼(色譜純，上海麥克林生化技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 透明葉觀察法

選取主脈部分的葉尖、葉基和葉中部，葉表皮部分中部的葉緣及主脈和葉緣之間的葉中(部分樣品于多個部位的葉片和葉緣上取樣，范圍為葉尖部到葉基部)共5個部位，徒手切片法取5 mm×5 mm的小塊，加60 ℃離析液保持40 min使葉片透明，加醋酸甘油1～2滴封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察葉正面和背面腺毛形態(tài)特征并拍照[9]。

2.2 組織化學(xué)觀察法

取葉中約5 mm×5 mm的小塊，分別用1，4-對亞硝基苯酚(單萜類成分染色劑)、2，4-二硝基苯肼(萜類成分染色劑)染色后用光學(xué)顯微鏡觀察拍照[10-11]。

3 結(jié)果

3.1 腺毛類型及分布

3.1.1類型 通過觀察成熟葉Ⅰ的腺毛發(fā)現(xiàn)，紫蘇的腺毛分為盾狀腺毛和頭狀腺毛2類。其中，盾狀腺毛又名腺鱗，由單細(xì)胞或多細(xì)胞構(gòu)成，含有多個分泌細(xì)胞并呈輻射狀排列[12]。這2類腺毛都由基細(xì)胞、莖細(xì)胞和頭部細(xì)胞3部分組成。盾狀腺毛的組成為基細(xì)胞1、短小的莖細(xì)胞1、頭部細(xì)胞8。成熟的盾狀腺毛中，頭部細(xì)胞通?？梢姶罅繐]發(fā)油狀分泌物(圖1)。頭狀腺毛有長柄頭狀腺毛和短柄頭狀腺毛2種。長柄頭狀腺毛包括1枚基細(xì)胞、2枚伸長的莖細(xì)胞及1或2枚頭部細(xì)胞(圖2～3)。短柄頭狀腺毛包括1枚基細(xì)胞、1枚較短的莖細(xì)胞及1、2或4枚頭部細(xì)胞(圖4～7)。

注：PGT表示盾狀腺毛細(xì)胞；下圖同。圖1 位于紫蘇葉背面的頭部8個細(xì)胞的盾狀腺毛

注：CGT表示頭狀腺毛細(xì)胞；下圖同。圖2 位于紫蘇葉背面葉脈的頭部有1個細(xì)胞的頭狀腺毛

圖3 位于紫蘇葉背面葉脈的頭部有2個細(xì)胞的頭狀腺毛

圖4 位于紫蘇葉正面的頭部有2個細(xì)胞的頭狀腺毛

圖5 位于紫蘇葉正面葉脈的頭部有1個細(xì)胞的頭狀腺毛

圖6 位于紫蘇葉正面葉脈的頭部有2個細(xì)胞的頭狀腺毛

3.1.2分布 紫蘇的葉片兩面均生有腺毛，葉正面僅有短柄頭狀腺毛，分布于葉脈和非葉脈部分的葉表皮，頭部以2細(xì)胞為主，少有1細(xì)胞，稀有4細(xì)胞見于葉脈上。葉背面兼有盾狀腺毛和2種頭狀腺毛，盾狀腺毛數(shù)量大，分布于葉脈和葉表皮上，短柄頭狀腺毛也以頭部2細(xì)胞為主，1細(xì)胞少見，分布于葉脈和葉表皮上，長柄頭狀腺毛稀見于葉脈(表1)。

表1 紫蘇葉腺毛分布情況

3.2 組織化學(xué)鑒定

對紫蘇成熟葉片進(jìn)行組織化學(xué)鑒定，結(jié)果表明，2種頭狀腺毛均未產(chǎn)生顏色變化(圖8～9)，表明頭狀腺毛中萜類成分較少。而紫蘇葉片上成熟的盾狀腺毛經(jīng)4-亞硝基苯酚染色后呈深棕褐色(圖8)，經(jīng)2，4-二硝基苯肼染色后呈深紅褐色(圖9)，說明單萜類成分主要存在于紫蘇葉片的成熟盾狀腺毛中。

圖8 4-亞硝基苯酚染色紫蘇葉片腺毛

圖9 2，4-二硝基苯肼染色紫蘇葉片腺毛

3.3 盾狀腺毛的發(fā)育過程

3.3.1不同生長階段的葉片 幼葉Ⅰ正面和背面均被大量非腺毛覆蓋(圖10～11)，背面多數(shù)盾狀腺毛頭部為8細(xì)胞，尚有部分頭部細(xì)胞為2～6個不等，或不可見清晰的頭部細(xì)胞。幼葉Ⅱ盾狀腺毛基本發(fā)育完全，具有8細(xì)胞的頭部(圖12～13)，僅葉基上的部分盾狀腺毛是未完全發(fā)育的狀態(tài)。

注：NG表示非腺毛；下圖同。圖10 幼葉Ⅰ葉尖背面的腺毛

圖11 幼葉Ⅰ葉尖正面的腺毛

圖12 幼葉Ⅱ葉基背面盾狀腺毛

圖13 幼葉Ⅱ葉尖背面盾狀腺毛

成熟葉全部為8細(xì)胞頭部的盾狀腺毛，但腺毛密度有所降低(圖14～16)。

圖14 成熟葉Ⅰ葉尖背面腺毛

圖15 成熟葉Ⅱ葉尖背面葉脈上盾狀腺毛

圖16 成熟葉Ⅰ葉基背面盾狀腺毛

綜上所述，盾狀腺毛在幼葉處發(fā)育程度，隨著葉片成熟至老化，其密度降低。無論是幼葉還是成熟葉中，均可觀察到盾狀腺毛產(chǎn)生一定量的分泌物。

3.3.2同一葉片的不同部位 幼葉至成熟葉葉脈上的盾狀腺毛充滿分泌物，分泌物由尖部至基部逐漸出現(xiàn)。葉脈同一位點上的盾狀腺毛有2種狀態(tài)并存現(xiàn)象，即充滿分泌物及未見大量分泌物狀態(tài)(圖17～18)。無論幼葉還是完全成熟的葉片均有此現(xiàn)象(圖15)。

圖17 幼葉Ⅰ葉尖背面葉脈上盾狀腺毛

圖18 幼葉Ⅰ葉尖背面葉脈上盾狀腺毛

幼葉期，葉表皮上由尖部至基部發(fā)育程度逐漸降低，而腺毛密度變大。同一位點上，盾狀腺毛的分泌程度差異較小(圖12～13)；成熟期葉表皮腺毛的變化情況類似，由尖部至基部密度變大，均為具有較多分泌物的成熟盾狀腺毛(圖14、16)。

與位于葉脈上的盾狀腺毛相比，位于葉表皮上的盾狀腺毛更早開始充斥分泌物。隨著葉片逐漸成熟，葉脈的同一位點可持續(xù)發(fā)育出新成熟的盾狀腺毛并行使分泌功能。整體而言，葉表皮上的盾狀腺毛密度更大。

4 討論

唇形科不同屬種之間腺毛類型、分布和密度有所不同，可作為屬種間的一種分類特征，不同種類中擁有腺毛的類型為1種或2種[13-14]。本研究中3份紫蘇種質(zhì)的表現(xiàn)具有較好的一致性，葉片上的腺毛類型有頭狀腺毛和盾狀腺毛2種，與唇形科鼠尾草屬和假荊芥屬植物類似。其中，頭狀腺毛又分為短柄腺毛和長柄腺毛2種[15-17]。前期研究表明，紫蘇盾狀腺毛數(shù)量較多且分布在葉片背面，由1個基部細(xì)胞、1個莖部細(xì)胞及1個包括8個分泌細(xì)胞的膨大頭部組成；紫蘇的頭狀腺毛由1個基部細(xì)胞、1個莖部細(xì)胞和1個包括1、2、4個分泌細(xì)胞的頭部組成[6-8]。本研究結(jié)果與此前報道一致，但未發(fā)現(xiàn)頭部有16個細(xì)胞組成的盾狀腺毛[8]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，盾狀腺毛不僅分布在非葉脈的葉表皮上，還有較多出現(xiàn)葉脈上；頭部為1、2個細(xì)胞的短柄頭狀腺毛廣泛分布于葉正面和背面的葉表皮和葉脈上，且葉脈上較多。首次發(fā)現(xiàn)2種稀有頭狀腺毛，一種是頭部為4個細(xì)胞的短柄頭狀腺毛，另一種是由1個基細(xì)胞、2個伸長的莖細(xì)胞及1、2個頭部細(xì)胞組成的長柄頭狀腺毛。這2種腺毛僅分布于葉背面葉脈上且較為少見。

本研究中，3份紫蘇種質(zhì)的盾狀腺毛密度及發(fā)育無明顯差異。紫蘇幼葉的盾狀腺毛已經(jīng)有較大的密度和分泌程度，至成熟葉時盾狀腺毛的密度開始下降。與先前報道發(fā)現(xiàn)的紫蘇腺毛在幼葉形成時已完成發(fā)育、成熟葉上無新腺毛產(chǎn)生基本一致[6]。紫蘇葉表皮上分布的盾狀腺毛密度較大，在相同位點上葉表皮的盾狀腺毛發(fā)育情況基本相同，而葉脈上分布的盾狀腺毛密度較低，且同一位點上可觀察到腺毛發(fā)育程度不同，其分泌物含量也有較大差異。無論是葉表面還是葉脈，由尖部至基部的盾狀腺毛的發(fā)育程度降低且密度變大。綜上所述，研究整張葉片的腺毛分布可以選擇即將完全成熟葉，尤其是葉片表面的中部。對該部位的盾狀腺毛的研究，在應(yīng)用方面更具有現(xiàn)實意義，也與揮發(fā)油產(chǎn)量有較高的相關(guān)性[9]。

植物次生代謝產(chǎn)物定位常用組織化學(xué)染色實現(xiàn)[18-19]。前期關(guān)于植物組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉片表皮萜類物質(zhì)主要存在于盾狀腺毛的分泌物中[9]，與報道中鼠尾草屬和假荊芥屬唇形科植物一致[15，17]。研究表明，薄荷中萜類物質(zhì)的最大合成率取決于處在分泌時期的腺毛數(shù)量，而盾狀腺毛是分泌精油的主要腺體。因此，盾狀腺毛數(shù)量越多，分泌越旺盛，揮發(fā)油合成率越高[20]。薄荷品質(zhì)評價的研究明確了盾狀腺毛數(shù)量與揮發(fā)油產(chǎn)量存在顯著正相關(guān)關(guān)系，可用于質(zhì)量評價[21]。紫蘇的盾狀腺毛與揮發(fā)油產(chǎn)量似乎也有類似的關(guān)系。本課題組前期研究認(rèn)為，紫蘇葉片揮發(fā)油隨葉片成熟迅速合成積累，葉片不同成熟度的揮發(fā)油得率為成熟葉(0.93%)>嫩葉(0.50%)>老熟葉(0.36%)[2]。本研究中觀察到，幼嫩葉上盾狀腺毛密度>老熟葉片盾狀腺毛密度。因此，推斷紫蘇盾狀腺毛密度與揮發(fā)油產(chǎn)量具有一定正相關(guān)，值得進(jìn)一步研究探討。