斯智萍，徐世芳

（1.浙江核力欣健藥業(yè)有限公司，浙江 湖州 313000； 2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310013）

瑞舒伐他汀鈣為全化學(xué)合成藥，自日本鹽野義制藥株式會(huì)社首次研發(fā)成功（專(zhuān)利號(hào)：JP5178841B）以來(lái)，不少生產(chǎn)廠家研究出了不同的合成工藝路線。其中，英國(guó)阿斯利康公司（獲得該藥的技術(shù)轉(zhuǎn)讓?zhuān)┞氏忍岢隽藢⑧奏つ负俗龀闪}，將叔丁酯做成側(cè)鏈醛，然后經(jīng)Wittig反應(yīng)縮合得到瑞舒伐他汀骨架，再經(jīng)脫保護(hù)、堿水解而轉(zhuǎn)化成鈣鹽，從而得到瑞舒伐他汀鈣[1－4]。該經(jīng)典合成線路中，叔丁酯側(cè)鏈醛[（4R－順式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己環(huán)－4－乙酸叔丁酯]作為關(guān)鍵的中間物料逐漸市場(chǎng)化，分析其合成工藝，該產(chǎn)品可能殘留乙醇、乙醛、甲苯、二甲硫醚等有機(jī)溶劑。為考察所購(gòu)叔丁酯側(cè)鏈醛的質(zhì)量，進(jìn)一步控制瑞舒伐他汀鈣的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究中采用頂空氣相色譜法對(duì)叔丁酯側(cè)鏈醛中的乙醇、乙醛、甲苯、二甲硫醚的殘留進(jìn)行了考察，并進(jìn)行了方法學(xué)研究，以期為瑞舒伐他汀鈣合成中間物料的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890A型氣相色譜儀、7697A型頂空進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；QP 2010 Ultra/SE型氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本Shimadzu公司）；XPE205型電子天平（瑞士Mettler公司）。

1.2 試藥

乙醇（色譜純，批號(hào)為K48709227），二甲基亞砜（色譜純，批號(hào)為10956900），均購(gòu)自Merck KgaA公司；乙醛（Aladdin Industrial Corporation，批號(hào)為20181208，含量為99%）；二甲硫醚（西格瑪奧德里奇＜上海＞貿(mào)易有限公司，批號(hào)為20180706，含量≥99.0%）；甲苯（杭州雙林化工試劑廠，批號(hào)為20141008，含量≥99.5%）；（4R－順式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己環(huán)－4－乙酸叔丁酯樣品（江蘇某制藥有限公司，物料代號(hào)為DK001Y－SM2，批號(hào)為SQ－D7－160701）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為以6%氰丙基苯基－94%二甲基聚硅氧烷為固定相的Rtx－624毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，1.4μm），程序升溫（初始溫度為60℃，保持15 min，以40℃/min的速率升至240℃，保持5 min）；火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為250℃，進(jìn)樣口溫度為200℃，分流比為30∶1，載氣為氮?dú)猓豁斂者M(jìn)樣，平衡溫度為90℃，平衡時(shí)間為30 min，定量環(huán)溫度為120℃，傳輸線溫度為130℃；進(jìn)樣量為1 mL。

質(zhì)譜條件：GCMSSolution 2.71工作站；電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Full Scan，質(zhì)量掃描范圍m/z為45～550。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：稱(chēng)取乙醇、乙醛、二甲硫醚及甲苯對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加二甲基亞砜溶解，制成每1 mL約含乙醇50 mg、乙醛38.5 mg、甲苯9 mg及二甲硫醚10 mg的混合對(duì)照品貯備液；逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥擅? mL含乙醇0.5 mg、乙醛0.385 mg、甲苯0.09 mg及二甲硫醚0.1 mg的混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：稱(chēng)取樣品0.5 g，精密稱(chēng)定，置20 mL頂空瓶中，精密加入5 mL二甲基亞砜，即得，壓蓋密封。

空白溶劑：以二甲基亞砜作為空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品溶液、空白溶劑及100%限度濃度加標(biāo)供試品溶液各5.0 mL，分別置20 mL頂空瓶中，壓蓋密封。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄氣相色譜圖。結(jié)果空白溶劑對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，供試品溶液中含有多個(gè)其他未知峰，但所測(cè)溶劑乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯峰與各相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。詳見(jiàn)圖1。

圖1 典型氣相色譜圖1.acetaldehyde 2.ethanol 3.dimethyl sulfide 4.tolueneA.Blank solvent B.Mixed reference solution C.Spiked test solutionFig.1 Typical GC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取混合對(duì)照品貯備液0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，2.0 mL，分別置100 mL容量瓶中，用二甲基亞砜定容，即得殘留溶劑系列混合對(duì)照品溶液。各精密量取5 mL，置20 mL頂空瓶中，壓蓋密封。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、各待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及線性范圍。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品溶液5 mL，置20 mL頂空瓶中，平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯峰面積的RSD均小于10.0%（n=6），表明儀器的精密度良好。

檢測(cè)限與定量限考察：將2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e以信噪比（S/N）為3和10時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢測(cè)限和定量限。進(jìn)樣分析，記錄氣相色譜圖，測(cè)得乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯的檢測(cè)限和定量限（見(jiàn)表2）。定量限的精密度RSD均小于10%（n=6），表明該方法靈敏度好。

表2 檢測(cè)限與定量限檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of LOD and LOQ

回收率試驗(yàn)：取混合對(duì)照品貯備液0.8，1.0，1.2mL，分別置100 mL容量瓶中，配制低、中、高3種質(zhì)量濃度（各溶劑限度的80%，100%，120%）的混合對(duì)照品溶液。取樣品0.5 g，置20 mL頂空瓶中，分別精密加入3種不同濃度的混合對(duì)照品溶液各5.0 mL，每種濃度各制備3份。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3至表6。

表3 乙醛回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test of acetaldehyde（n=9）

表4 乙醇回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.4 Results of the recovery test of ethanol（n=9）

表5 二甲硫醚回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.5 Results of the recovery test of dimethyl sulfide（n=9）

表6 甲苯回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.6 Results of the recovery test of toluene（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品0.5 g，依法制備供試品溶液，平行2份，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖（見(jiàn)圖2）。結(jié)果供試品溶液中乙醛、乙醇、二甲硫醚、甲苯的含量分別為0.002%，0.008%，0.001%，0.005%。

圖2 供試品溶液氣相色譜圖1.acetaldehyde 2.ethanol 3.dimethyl sulfide 4.tolueneFig.2 GC chromatograms of test solution

為進(jìn)一步鑒定樣品中未知溶劑峰，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件，對(duì)供試品溶液進(jìn)行氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC－MS）分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)合NIST譜庫(kù)檢索功能，扣除空白溶劑峰的干擾，對(duì)供試品溶液中較大的10個(gè)未知峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬，鑒定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 供試品溶液中10種鑒定的未知化合物結(jié)構(gòu)信息表Tab.7 Structure information of 10 unknown compounds identified in the test solution

圖3 供試品溶液氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜總離子流圖Fig.3 Total ion flow of test solution by GC-MS/MS

3 討論

3.1 進(jìn)樣方式選擇

氣相色譜的進(jìn)樣方式有直接進(jìn)樣及頂空進(jìn)樣。直接進(jìn)樣快速、方便、準(zhǔn)確，頂空進(jìn)樣溫度較低，可避免樣品熱解損失及非揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)進(jìn)樣口和毛細(xì)管柱的污染[5－9]。預(yù)試驗(yàn)中，樣品在直接進(jìn)樣－氣相色譜分析中，主成分有較大響應(yīng)，導(dǎo)致某些殘留溶劑可能被包裹在主成分中而漏檢，故最終選擇頂空進(jìn)樣方式。

3.2 溶劑選擇

頂空氣相色譜法選用的溶劑多為水，但由于該中間物料不溶于水，故先后考慮了溶解能力較強(qiáng)的二甲基亞砜及二甲基甲酰胺。待測(cè)殘留溶劑甲苯的沸點(diǎn)較高，出峰靠后，為了不干擾測(cè)定，最終選擇了二甲基亞砜。

3.3 頂空條件選擇

預(yù)試驗(yàn)中采用單因素考察方法確定了最佳平衡時(shí)間和平衡溫度。固定平衡時(shí)間，考察不同平衡溫度（70，80，90，100℃）下待測(cè)成分響應(yīng)值的變化，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，待測(cè)成分響應(yīng)值增加，但由于90℃與100℃的響應(yīng)值無(wú)明顯差異，考慮溫度過(guò)高可能使樣品發(fā)生熱解，故選擇平衡溫度為90℃。固定平衡溫度，考察不同平衡時(shí)間（20，25，30，35 min）對(duì)待測(cè)成分響應(yīng)值的影響，發(fā)現(xiàn)平衡30 min后再繼續(xù)延長(zhǎng)平衡時(shí)間，待測(cè)成分的響應(yīng)值并無(wú)明顯增加，故選擇平衡時(shí)間為30 min。

3.4 頂空瓶溶劑體積選擇

頂空體積的大小對(duì)檢測(cè)靈敏度、精密度有重要影響[10]。預(yù)試驗(yàn)中分別考察了溶劑體積為1，3，5，7 mL時(shí)待測(cè)成分響應(yīng)值的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶劑體積小于頂空瓶體積的1/3時(shí)，隨著溶劑體積的增加，響應(yīng)值增加；溶劑體積為7 mL時(shí)的響應(yīng)值與5 mL時(shí)無(wú)明顯差異，且精密度略有降低，故將溶劑體積確定為5 mL。

3.5 供試品中其他未知溶劑峰的鑒定

為進(jìn)一步鑒定樣品中的未知溶劑峰，采用GC－MS法對(duì)供試品溶液中較大的10個(gè)未知峰進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。由于樣品為供應(yīng)商提供的工藝研究批次樣品，對(duì)乙醛、乙醇、二甲硫醚和甲苯等4種殘留有機(jī)溶劑測(cè)定的目的，只是為供應(yīng)商提供一種有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定參考方法，故未對(duì)鑒定出的10種含量較大的溶劑峰做進(jìn)一步追溯。后續(xù)需與物料供應(yīng)商接洽反饋該試驗(yàn)結(jié)果，建議其從生產(chǎn)工藝及試驗(yàn)溶劑著手，在生產(chǎn)過(guò)程中加上溶劑清洗的步驟，對(duì)該物料做進(jìn)一步純化處理，并要求供應(yīng)商對(duì)優(yōu)化工藝再行分析，根據(jù)實(shí)際情況對(duì)殘留溶劑進(jìn)行定量控制，做好中間物料的控制。

3.6 方法評(píng)價(jià)

本研究中通過(guò)對(duì)溶劑、頂空平衡時(shí)間及平衡溫度等條件的優(yōu)化試驗(yàn)，建立了對(duì)測(cè)定瑞舒伐他汀鈣合成中間物料（4R－順式）－6－醛基－2，2－二甲基－1，3－二氧己環(huán)－4－乙酸叔丁酯中的乙醛、乙醇、二甲硫醚及甲苯等4種有機(jī)溶劑殘留量的頂空氣相色譜法。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，各組分間的分離度較好。該研究為復(fù)雜樣品基質(zhì)中有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定提供了參考，為供應(yīng)商對(duì)該物料的生產(chǎn)純化提供了方向。