封二飛，張筱宜，趙 明

（首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069）

無菌藥品的無菌性是至關(guān)重要的質(zhì)量屬性，但當(dāng)前僅以概率性抽檢作為無菌檢測方式。要全面保障藥品的無菌性，不能僅依靠無菌檢測，還要基于質(zhì)量源于設(shè)計的原則，對產(chǎn)品包裝進(jìn)行良好的設(shè)計和對生產(chǎn)制造過程進(jìn)行控制。因此，容器密封完整性檢測越來越受到國內(nèi)外監(jiān)管機構(gòu)的重視。中國、歐盟和美國對無菌藥品容器密封完整性檢測的監(jiān)管法規(guī)要求及各種檢測方法的技術(shù)特性和進(jìn)展在《美國藥典》和國內(nèi)文獻(xiàn)中均有描述和報道[1]。本研究中參照《美國藥典》（第41版，第1 207章，無菌產(chǎn)品包裝——完整性評估），選擇當(dāng)前制藥企業(yè)常用的5種檢測方法，通過陰性樣品檢測呈現(xiàn)不同檢測儀器和方法的特點，根據(jù)陽性樣品檢測結(jié)果呈現(xiàn)不同檢測方法的檢測靈敏度，經(jīng)過綜合對比，為國內(nèi)藥品研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)更好地選擇容器密封完整性檢測方法提供參考。

1 檢測方法

1.1 真空衰減法

美國材料試驗學(xué)會（ASTM）于2009年推出了真空衰減法作為包裝無損檢漏的測試標(biāo)準(zhǔn)（標(biāo)準(zhǔn)號ASTM F2338－09），后來得到了美國食品和藥物管理局（FDA）的批準(zhǔn)和認(rèn)可。真空衰減法是將包裝容器置于專門的測試腔體內(nèi)，測試腔體抽真空，使容器內(nèi)外產(chǎn)生壓力差，如有泄露，容器內(nèi)部的氣體會通過漏孔進(jìn)入測試腔體，儀器壓力傳感器監(jiān)測到壓力變化，將壓力變化值和標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，從而判定是否泄漏。該檢測方法能將壓力變化數(shù)值成比例換算成泄露孔徑大小[2]，可作為確定性檢漏方法使用。

1.2 高壓放電法

高壓放電法是通過在待檢樣品上外加高壓電，根據(jù)無缺陷和有缺陷時的電學(xué)參數(shù)及表征差異確認(rèn)待檢樣品的密封性[3]。

1.3 頂空氣體激光法

頂空氣體激光法是通過監(jiān)測容器頂空氧含量變化來判定容器的密封性，其測定原理是發(fā)射的近紅外激光穿透容器頂空，容器頂空的氧對激光有吸收，激光吸收量和對應(yīng)的氧含量成正比[4]。為保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免外界空氣的干擾，通常測試樣品腔體周圍須用高純氮氣（99.99%）充盈保護(hù)。

1.4 微生物浸入法

微生物浸入法又稱微生物挑戰(zhàn)法，常通過微生物浸入試驗完成，為傳統(tǒng)檢測方法。先往產(chǎn)品容器內(nèi)灌入培養(yǎng)基，并按常規(guī)方式壓塞軋蓋（密封），滅菌后冷卻備用。無菌檢查（確認(rèn)培養(yǎng)基微生物挑戰(zhàn)前的無菌性）時，將冷卻后的合格樣品容器倒置，并將瓶口（密封處）完全浸沒于高濃度（如＞105cfu/mL）的運動性菌液（如大腸埃希菌Escherichiacoli、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa或黏質(zhì)沙雷菌Serratia marcescens）4 h后，將容器外表面消毒并培養(yǎng)，看是否有挑戰(zhàn)性細(xì)菌在容器內(nèi)生長。此時，需做陽性對照試驗，以確認(rèn)培養(yǎng)基的促菌生長能力[3]。微生物浸入試驗也可同無菌工藝模擬試驗（培養(yǎng)基模擬灌裝）同步進(jìn)行，將培養(yǎng)基模擬灌裝樣品無菌培養(yǎng)14 d，確認(rèn)無菌生長后，樣品再進(jìn)行微生物浸入試驗。于硬質(zhì)容器包裝（如西林瓶和安瓿瓶等），泄漏孔徑為0.1μm時會有液體滲出，0.3μm時會有微生物浸入。結(jié)果顯示，當(dāng)泄漏率＜6×10－6std·cm3/s時（真空模式下的氦質(zhì)譜分析測量），等同于泄漏孔徑為0.1～0.3μm，此時以微生物浸入法檢測成功率的P＜0.10[5－6]。

1.5 液體示蹤法（色水法）

通常選用的示蹤液體為亞甲基藍(lán)溶液，故又稱色水法，為傳統(tǒng)的檢測方法。操作時，取適量玻璃瓶，往玻璃瓶中灌入注射用水，按常規(guī)方法壓塞、軋蓋（膠塞、鋁蓋及樣品的處理最好模擬實際生產(chǎn)工藝）。樣品倒置，完全浸沒于裝有一定濃度亞甲基藍(lán)溶液的容器中。將容器放入真空箱中抽真空，維持一段時間，真空箱恢復(fù)至常壓；再給真空箱中施加一定壓力，維持一段時間，真空箱恢復(fù)至常壓。取出，用水沖洗瓶外壁，目檢。亞甲基藍(lán)溶液不得滲入瓶內(nèi)[3]。樣品內(nèi)溶液顏色不發(fā)生變化為合格。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

在無菌制劑車間通過培養(yǎng)基模擬灌裝試驗，灌裝出需要的6 mL西林瓶樣無菌陰性樣品，隨機選取6瓶作為供試品，在20～25℃和30～35℃條件下分別培養(yǎng)7 d，觀察是否存在微生物污染風(fēng)險。

2.2 檢測方法順序

為了避免檢測方法對培養(yǎng)基靈敏度的干擾，設(shè)定檢測方法順序為微生物浸入法、色水法、真空衰減法、高壓放電法、頂空氣體激光法。前2種方法均為傳統(tǒng)破壞性檢測，評判結(jié)果為合格和不合格，且均只試驗1次；后3種方法需重復(fù)檢測3次，以考察檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.3 試驗操作

2.3.1 微生物浸入法

儀器與試藥： 型ZXJR－1430霉菌培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；1316型生物安全柜（美國Thermo公司）；E200型顯微鏡（日本Nikon公司）。胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基干粉（德國Merck公司，批號為VM813650）；陰性無菌樣品（北京神州細(xì)胞工程有限公司，批號為M20200301，西林瓶包裝，規(guī)格為每支6mL；下同）。

方法與結(jié)果：配制質(zhì)量濃度為30 g/L的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶液。除菌過濾，無菌灌裝，充氮至6 mL西林瓶內(nèi)，每瓶的灌裝體積不少于4 mL。灌裝合格產(chǎn)品轉(zhuǎn)入霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)，在20～25℃（倒立培養(yǎng)）和30～35℃（正立培養(yǎng)）條件下分別培養(yǎng)至少168 h（24 h×7 d），培養(yǎng)期間連續(xù)監(jiān)控培養(yǎng)溫度。在培養(yǎng)期間和培養(yǎng)結(jié)束后，對所有供試品在規(guī)定照度下逐支目視檢查。之后，對無菌性檢查合格的供試品取樣6瓶待用。取制備好的新鮮銅綠假單胞菌菌液（濃度不低于1×106cfu/mL）倒入燒杯內(nèi)，讓供試品倒置在菌懸液中，使菌液浸沒瓶口鋁蓋至少4 h。之后，取出供試品，擦干容器外殘留的菌懸液，用無菌純化水沖洗干凈供試品外表面。取容器中的菌懸液在紫外光燈下觀察，能觀察到藍(lán)綠色熒光，染色后結(jié)果為革蘭陰性。取2瓶西林瓶，不經(jīng)菌液浸泡，其外表面用無菌純化水沖洗后，分別接入0.1 mL銅綠假單胞菌菌液（含菌量10～100 cfu），作為陽性對照。將表面沖洗后的供試品和陽性對照品放入包裝袋內(nèi)，置30～35℃條件下培養(yǎng)7 d，結(jié)果，供試品均不長菌，且通過促菌生長能力檢測試驗；陽性對照品長菌，檢測為銅綠假單胞菌。

分析：微生物浸入法試驗通常耗時較長（14～21d），操作要求嚴(yán)格，被認(rèn)為是結(jié)果可信度高但不能重現(xiàn)的方法。

2.3.2 色水法

儀器與試藥：MFY－05S型密封性測試儀（濟南三泉中心實驗儀器有限公司）；陰性無菌樣品。

方法與結(jié)果：配制10%（W/V）的亞甲基藍(lán)溶液，將供試品倒置于燒杯內(nèi)，浸沒于亞甲基藍(lán)溶液中。抽真空至真空度為25kPa，給供試品施加壓力0.2MPa，均維持1 800 s，恢復(fù)至常壓狀態(tài)再維持1 800 s。用無菌純化水沖洗干凈瓶外壁，逐支進(jìn)行人工燈檢，燈檢照度≥1000lx。結(jié)果顯示，供試品溶液顏色正常，未見藍(lán)色。

分析：色水法常被認(rèn)為檢測靈敏度較低，穩(wěn)定性較差[7]，且對檢測人員的燈檢水平依賴度高，結(jié)果重復(fù)性也較差。

2.3.3 真空衰減法

儀器與試藥：BE LF－S型真空檢漏儀（意大利Bonfiglioli Engineering公司）；陰性無菌樣品。

方法與結(jié)果：測試前儀器自檢確認(rèn)正常，將供試品逐支放入測試腔體內(nèi)，重復(fù)測試3次。結(jié)果顯示，未泄露。

2.3.4 高壓放電法

儀器與試藥：E－Scan 655型微電流高壓放電檢測儀（上海眾尋檢測技術(shù)有限公司）；陰性無菌樣品。

方法與結(jié)果：測試前儀器用標(biāo)準(zhǔn)電阻自檢確認(rèn)正常，將供試品逐支放入測試腔體內(nèi)，重復(fù)測試3次。結(jié)果顯示，未泄露，電壓值均低于5 V。

2.3.5 頂空氣體激光法

儀器與試藥：FMS－760型頂空氣體激光分析儀（美國Lighthouse公司）；陰性無菌樣品。

方法與結(jié)果：測試前儀器用0，1%，2%，4%，8%，25%的標(biāo)準(zhǔn)氧含量瓶自檢確認(rèn)一切正常，將供試品逐支放入測試腔體內(nèi)，重復(fù)測試3次。結(jié)果顯示，未泄露，氧含量均低于1%。

2.4 試驗結(jié)果

穩(wěn)定性、重復(fù)性與檢測效率：結(jié)果見表1。檢測時長的RSD、檢測結(jié)果的RSD分別與檢測儀器的穩(wěn)定性及檢測結(jié)果的重復(fù)性呈正相關(guān)?？梢?，3種確定性檢測方法結(jié)果的重復(fù)性均較好，且無明顯差異。對生產(chǎn)線預(yù)期配置在線檢測儀器進(jìn)行100%產(chǎn)品密封性檢測時，儀器方法的選擇要重點考慮檢測的穩(wěn)定性和檢測效率。

表1 確定性檢測方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計（n=3）Tab.1 Data statistics of deterministic leak test technologies（n=3）

靈敏度：離線抽樣進(jìn)行生產(chǎn)線樣品檢測時，要重點考慮檢測儀器的穩(wěn)定性和檢測靈敏度，這2項均為評價的關(guān)鍵指標(biāo)。本試驗未制作陽性樣品，可參考文獻(xiàn)[8]對除高壓放電法外的4種檢測方法進(jìn)行對比分析。國外文獻(xiàn)報道選用瑞士Wilco AG公司的Wilcoma?HAS－Lab頂空激光儀，Wilco AG公司的Wilcoma?07真空檢漏儀和德國Asslar公司的ASM340氦質(zhì)譜檢測儀，用標(biāo)準(zhǔn)泄露孔徑陽性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2?？梢?，色水法靈敏度最低，其次是真空衰減法；微生物浸入法靈敏度最高，其次是頂空氣體激光法。

表2 不同檢測方法的檢測靈敏度（%）Tab.2 Detection sensitivity of different test methods（%）

3 討論

結(jié)合試驗結(jié)果和文獻(xiàn)報道可知，2種概率性檢測方法中，色水法檢測靈敏度較低，穩(wěn)定性較差，但操作要求簡單，儀器成本低；微生物浸入法所得結(jié)果可信度較高，無須單獨采購特殊儀器，普通的微生物實驗室即可完成檢測，但結(jié)果不能重現(xiàn)。且2種方法均為破壞性試驗，對于小批量產(chǎn)品或高價值產(chǎn)品不太適用。

3種確定性檢測方法檢測結(jié)果的重現(xiàn)性均較好，靈敏度均較高，檢測過程對產(chǎn)品無損傷，既適合離線抽樣檢測，也適合整合到生產(chǎn)線進(jìn)行100%在線檢測。但檢測儀器的成本較高，后期計量維護(hù)的要求也較高。

由于本試驗樣品數(shù)較少，試驗結(jié)果不能反映各檢測方法之間絕對的優(yōu)劣差異，僅呈現(xiàn)各自儀器和方法的特點。后續(xù)可制作更多的陰性樣品和陽性樣品進(jìn)行對比研究。

密封性檢查方法為能檢測出產(chǎn)品最大允許泄漏限度的確定性方法，如方法靈敏度無法達(dá)到產(chǎn)品最大允許泄漏限度水平或產(chǎn)品最大允許泄漏限度不明確，建議至少采用2種方法（推薦包括微生物挑戰(zhàn)法）進(jìn)行研究[9]。

選擇檢測方法時要基于產(chǎn)品的具體情況，特別應(yīng)注意產(chǎn)品是否影響檢測方法的靈敏度，如高糖、高鹽或高黏度溶液。在產(chǎn)品的開發(fā)設(shè)計階段和包材選擇階段應(yīng)盡可能選擇靈敏度、穩(wěn)定性均較高的儀器和方法進(jìn)行離線檢測確認(rèn)，在后續(xù)日常生產(chǎn)和質(zhì)量控制過程中可選擇相對低靈敏度、高穩(wěn)定性、高檢測效率的儀器和方法進(jìn)行在線檢測。

當(dāng)前，概率性泄漏檢測方法由于儀器成本低、操作維護(hù)簡單而被國內(nèi)企業(yè)普遍使用；歐洲和美國企業(yè)則更多選擇確定性泄漏檢測方法，對于藥品出口企業(yè)需要考慮不同市場的監(jiān)管要求。

志謝：感謝北京神州細(xì)胞工程有限公司、北京市多肽及小分子藥物重點實驗室內(nèi)源式預(yù)防藥物教育部工程研究中心對本試驗的支持和幫助。