郭 寧，張曉洋，夏 玉，湯 丹，陳銘祥，王淑美△

（1.廣東醫(yī)科大學藥學院，廣東 東莞 523808； 2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

羰基化合物含有羰基官能團，主要包括醛酮化合物，在自然界廣泛存在。目前已有研究報道生物體內醛酮化合物的變化與很多疾病有關，如糖尿病患者血漿中有大量丙酮醛積累[1－2]；肺癌患者機體中己醛、庚醛的含量增加[3－5]；乙醛在體內的累積會增加女性患乳腺癌的概率[6]。因此，建立高選擇性、高靈敏度的醛酮化合物檢測方法對于早期臨床診斷具有重要意義。液相色譜串聯質譜（LC－MS）法因具有高選擇性、高靈敏度及高通量而被廣泛應用，但羰基化合物缺少易電離基團，在質譜分析過程中難以帶上電荷，因而用于羰基化合物的檢測受限?；贚C－MS的化學衍生化技術有優(yōu)越性[7]，能通過向目標分析物中引入易電離的化學基團來提高其質譜檢測的離子化效率[8－10]。吉拉德試劑P（GP）能在弱酸性條件下與醛酮化合物的羰基發(fā)生席夫堿反應，反應條件溫和，可形成碳氮雙鍵。另外，GP含有季銨基團，能顯著提高衍生產物的離子化效率，從而提高其在質譜檢測中的靈敏度?；谝陨咸攸c，本研究中擬選用GP作為羰基化合物的衍生化試劑，以苯甲醛、己醛、庚醛、2－壬酮、2－庚酮5種樣品為目標分析物，建立GP衍生結合LC－MS法檢測羰基化合物，從而提高羰基化合物的質譜檢測靈敏度?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Triple Quad 4500型高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀，包括電噴霧離子源（ESI）、數據處理軟件Analyst 1.6 Software（美國AB SCIEX公司）；LC－20AD型高效液相色譜系統，包括DGU－20A3型脫氣機、LC－20AD型二元梯度泵、SIL－20A型自動進樣器、CTO－20AC型柱溫箱（日本Shimadzu公司）；微量移液槍（大龍興創(chuàng)實驗儀器＜北京＞有限公司，規(guī)格分別為10，20，1 000μL）；針式樣品過濾器（規(guī)格為0.22μm）；有機微孔濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司，規(guī)格為0.22μm）；ATX124型電子天平（日本Shimadzu公司，精度為萬分之一）；臺式高速離心機（江蘇科析儀器有限公司）；MS－100型恒溫混勻儀（杭州奧盛儀器有限公司）；DC150－1B型氮吹儀（杭州佑寧儀器有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜級，含量≥99.9%），乙醇（色譜級，含量≥99.8%），均購于美國Tedia公司；苯甲醛（色譜級，含量≥99.5%），己醛（色譜級，含量≥99.0%），庚醛（色譜級，含量≥98%），2－壬酮（含量99%），2－庚酮（含量99%），吡啶（化學級，含量99.8%），氯乙酸乙酯（化學級，含量98%），均購于阿拉丁生化科技股份有限公司；吡啶、水合肼、甲酸、冰醋酸（分析級，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 GP合成

GP的合成方法參考文獻[11]，合成過程見圖1。精密稱取吡啶（0.396 g，5 mmol）、氯乙酸乙酯（0.613 g，5 mmol），精密量取乙醇12 mL，依次加入圓底燒瓶中，加入磁子攪拌；混合液在85℃條件下加熱攪拌回流6 h，混合液冷卻至室溫；攪拌并緩慢加入水合肼溶液（0.25 g，5 mmol）。室溫下連續(xù)攪拌30 min得固體產物，然后用低溫無水乙醇清洗，于真空干燥箱中干燥2 h，得0.672 g白色固體產物，產率為71.9%。1H－NMR（400 MHz，D2O）δ：8.94－8.83（2H，m，H－Ar－o），8.65－8.54（1H，m，H－Ar－p），8.08（2H，m，H－Ar－m），5.79（1H，s，NH），5.40（2H，s，H－2），3.24－3.21（2H，m，NH2）。13C－NMR（100 MHz，D2O）δ：169.05（C－1），164.3（C－Ar－o），146.1（C－Ar－p），127.65（C－Arm），60.46（C－2）。

圖1 GP合成路線Fig.1 The synthetic route of GP

2.2 GP質譜圖

稱取合成的GP 21.291 2 mg，精密稱定，置8 mL樣品瓶中，加入7mL甲醇制成20μmol/mL的標品；量取10μL GP母液逐級稀釋至200 nmol/mL，進行質譜分析，一級質譜圖見圖2 A，GP的質荷比（m/z）為152.1；二級碎裂質譜圖見圖2 B，GP有m/z80.1和m/z120.1的碎片離子；由圖2 C可知，m/z80.1的碎片離子來自GP的吡啶環(huán)，m/z120.1的碎片離子是GP失去NH2－NH2后成環(huán)得到。由以上結果判斷，已合成出GP。

圖2 GP質譜圖及結構推測A.The primary mass spectrogram B.The secondary mass spectrogram of fragment ions C.Structure speculation of fragment ionsFig.2 The mass spectrogram and structure speculation of GP

2.3 GP液相色譜串聯質譜分析

色譜條件：色譜柱為Shimadzu InertsilTMODS－3柱（100 mm×2.1 mm，3μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0 min時5%B，5 min時5%B，22 min時40%B，40 min時90%B，45 min時90%B，48 min時5%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為5μL。

質譜條件：正離子模式下的多反應監(jiān)測模式（MRM），離子源溫度為550℃，噴霧電壓為4.5 kV，霧化氣為40 psi，氣簾氣壓為40 psi，干燥氣為60 psi。

分析結果：GP與醛酮化合物衍生化反應式見圖3。5種衍生化產物的質譜參數和色譜保留時間見表1。

表1 5種衍生化產物的質譜參數和色譜保留時間Tab.1 The Mass spectrometric parameters and chromatographic retention time of five derivatization products

圖3 GP與醛酮化合物衍生化反應式Fig.3 The derivatization reaction equation of GP with the aldosterone compounds

2.4 GP標記樣品質譜特征

5種衍生化產物的二級碎裂質譜圖見圖4。結果顯示，樣品經GP標記后形成帶正電的腙；5種樣品在GP標記后都產生相同的特征碎片離子m/z80.1，該碎片來自GP的吡啶環(huán)；且均含有1個丟失了79 Da的子離子。由上述結果可知，GP能標記這5種樣品。

圖4 5種衍生化產物的二級碎裂質譜圖A.GP－benzaldehyde B.GP－h(huán)exaldehyde C.GP－h(huán)eptaldehyde D.GP－2－nonone E.GP－2－h(huán)eptanoneFig.4 The secondary mass spectrogram of fragment ions of five derivatization products

2.5 衍生化反應條件優(yōu)化

為了獲得較好的標記效率，本研究中優(yōu)化了衍生化反應條件，包括衍生化反應溫度、醋酸用量、GP用量及反應時間[12]，所有反應均在200μL甲醇體系中執(zhí)行。標品用量均為1 nmol。

衍生化反應溫度：分別選擇30，40，50，60，70℃作為反應溫度，GP用量為1.5μmol，15 000 r/min振蕩反應3 h。結果表明，在反應溫度為40℃時，衍生化產物的峰面積最大（見圖5 A）。故選擇衍生化反應溫度為40℃。

醋酸用量：醋酸用量的考察范圍是0～10%。結果表明，當醋酸用量為1%時，衍生化產物的峰面積已達到平臺（見圖5 B）。故選擇醋酸用量為1%。

GP用量：GP與樣品物質量之比考察范圍為50～1 000倍。結果表明，當GP與樣品物質量之比為300時，衍生化產物的峰面積達到平臺（見圖5 C）。故選擇GP用量為300倍。

反應時間優(yōu)化：優(yōu)化范圍為0.5～10.0 h。結果表明，當反應時間從0.5 h增加至3.0 h時，衍生化產物的峰面積比逐漸增加，3.0h后，峰面積比不再增加（見圖5 D）。故選擇反應時間為3.0 h。

圖5 優(yōu)化衍生化反應條件A.Reaction temperature B.The percentage of acetic acid C.The molar ratio of GP to standards D.Reaction timeFig.5 Optimization of derivatization reaction conditions

通過以上優(yōu)化，最優(yōu)GP標記反應條件為，在200μL甲醇反應體系中，40℃下反應3.0 h，醋酸用量為1%，GP與標品的物質的量之比為300。

2.6 衍生化產物色譜行為

對5個標品衍生前后分別進行LC－MS分析，5個衍生化產物的色譜圖見圖6?？梢?，非衍生狀態(tài)時5個標品由于離子化效率低，即使很高濃度時仍未檢測到信號，而衍生后均有明顯信號。其中，苯甲醛、己醛、2－庚酮、庚醛、2－壬酮的保留時間分別為7.85，10.62，12.66，14.12，17.19 min。

圖6 5種衍生化產物色譜圖Fig.6 The ion chromatograms of five derivatization products

2.7 衍生前后靈敏度比較

在最優(yōu)衍生化條件下，將苯甲醛、己醛、庚醛、2－壬酮、2－庚酮制成濃度為0.25，2.5，25，250 pmol/mL的混標溶液，以GP標記，進行質譜分析，其中以信噪比（S/N）為3∶1時作為檢測限（LOD）。結果顯示，當非衍生狀態(tài)時，5個樣品在質譜上看不到峰，無法用質譜檢測；經過GP標記后，5個衍生化產物的LOD分別為0.81，0.53，0.26，0.02，0.28 pmol。這表明經GP衍生后大大提高了5種樣品質譜檢測的靈敏度。其中，GP的季銨部分對于靈敏度的提高起了很大作用。

3 討論

本研究中利用GP作為羰基化合物的衍生化試劑，基于席夫堿反應，其結構中的氨基可與羰基化合物的羰基形成碳氮雙鍵，其結構中的季銨鹽基團極易帶電，故可提高羰基化合物在質譜檢測中的靈敏度。GP標記5種標品的二級碎片中均有1個m/z80.1的碎片，該碎片來自GP的吡啶環(huán)部分，這一特點可提高羰基化合物的選擇性。所建立的方法對羰基化合物的分析有2個優(yōu)勢：1）通過GP衍生，向羰基化合物中引入了季銨結構，提高了羰基化合物的質譜離子化效率，進而提高了正離子掃描模式下質譜檢測的靈敏度。2）GP衍生后，衍生化產物的二級碎片中均含有1個m/z80.1的碎片，基于此特點，在研究非目標性化合物時可從眾多分析物中篩選出羰基化合物，提高羰基化合物的選擇性。另外，由于席夫堿反應中的氨基不僅可與飽和醛酮化合物反應，還可與不飽和醛酮化合物反應，故GP不僅可檢測飽和醛酮化合物，還可檢測不飽和醛酮化合物。

綜上所述，所建立的GP衍生結合LC－MS法檢測羰基化合物，大大提高了羰基化合物在質譜中的檢測靈敏度，豐富了羰基化合物的質譜檢測方法。