毛 輝，儲(chǔ)春霞，朱秋莎，孟 詩(shī)，周 雪，顧明星，費(fèi) 翔，袁 月△

（1.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 金華 321007； 2.南京盛德瑞爾醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 南京 210047；3.韓國(guó)嘉泉大學(xué)，仁川 21936）

冠狀病毒（CoV）是一類(lèi)廣泛存在的、對(duì)人類(lèi)和家畜均有重大潛在威脅的病原微生物，最初于1937年在雞的感染組織中被發(fā)現(xiàn)。2003年暴發(fā)的重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS－CoV）疫情在全球共有約8 000例感染病例，死亡率約為10%，高致死率及特效藥物的缺乏引起了全球恐慌。2019年12月暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID－19）疫情由新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）引起，SARS－CoV－2與SARS－CoV具有高度同源性，截至2020年6月10日，全球已有確診病例超過(guò)700萬(wàn)，死亡病例超過(guò)40萬(wàn)[1－3]。SARS－CoV－2的主要傳播途徑是呼吸道飛沫傳播和接觸傳染，但目前尚無(wú)專(zhuān)門(mén)針對(duì)SARS－CoV和SARS－CoV－2的治療藥物。本研究中探討了SARS－CoV－2 RNA依賴(lài)性RNA聚合酶（RdRp）抑制劑的篩選。病毒RdRp主導(dǎo)完成CoV的基因組復(fù)制過(guò)程，可準(zhǔn)確、高效地實(shí)現(xiàn)數(shù)萬(wàn)個(gè)核苷酸的合成。一線醫(yī)護(hù)人員和科研工作者們?cè)谒幬锖Y查中發(fā)現(xiàn)，抗埃博拉病毒的藥物瑞德西韋（remdesivir）的直接作用靶點(diǎn)為RdRp（見(jiàn)圖1 A）[4]。吉利德公司研究發(fā)現(xiàn)的抗丙型肝炎病毒（HCV）藥物索非布韋，為NS5B核苷類(lèi)聚合酶抑制劑（NPI），競(jìng)爭(zhēng)作用于NS5B的催化活性位點(diǎn)，插入到新合成的核苷酸鏈中以阻斷HCV的生命周期（見(jiàn)圖1 B，來(lái)自PDB文件4WTG）[5]。但還有另一類(lèi)非核苷類(lèi)聚合酶抑制劑（NNPI），以非競(jìng)爭(zhēng)方式與NS5B聚合酶催化部位的變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致蛋白重要構(gòu)象發(fā)生改變，干擾病毒的體內(nèi)復(fù)制過(guò)程，目前至少有5個(gè)變構(gòu)位點(diǎn)可作為NNPI藥物的靶點(diǎn)（NNPI－1～NNPI－5，見(jiàn)圖2，分別來(lái)自PDB文件1OS5，1YVF，2BRK，3FQL，1GX6）[6]。故考慮，CoV RdRp除了瑞德西韋所在結(jié)合位點(diǎn)外，可能也存在變構(gòu)位點(diǎn)。

圖1 抗病毒藥物作用位點(diǎn)A.Remdesivir B.SofosbuvirFig.1 Action sites of antiviral drugs

圖2 NS5B聚合酶的變構(gòu)位點(diǎn)A.PDB 1OS5 B.PDB 1YVF C.PDB 2BRK D.PDB 3FQL E.PDB 1GX6Fig.2 NS5B polymerase allosteric site

1 材料與方法

1.1 虛擬篩選軟件與材料

本研究中虛擬篩選軟件選用Maestro（Schrodinger 2020－2），蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)均來(lái)自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org），化合物結(jié)構(gòu)來(lái)自Npatla公司提供的化合物庫(kù)，其為以細(xì)菌和真菌代謝產(chǎn)物為主體的擬肽化合物小分子庫(kù)，共有2.4萬(wàn)個(gè)化合物。

1.2 方法

1.2.1 SARS－CoV－2－RdRp蛋白晶體結(jié)構(gòu)的處理

RdRp蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)可從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲得，PDB代碼為7BV2，晶體結(jié)構(gòu)分辨率為2.5?，為nsp12－nsp7－nsp8復(fù)合物，包含RNA鏈和磷酸形式的瑞德西韋結(jié)構(gòu)。用Maestro軟件的“protein preparation wizard”對(duì)7BV2結(jié)構(gòu)進(jìn)行修正化學(xué)鍵序，加氫，處理金屬離子，補(bǔ)齊缺失的原子與氨基酸殘基，刪除多余的分子等，然后在OPLS力場(chǎng)條件下對(duì)蛋白進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，最終以此作為分子對(duì)接的受體。

1.2.2 藥物結(jié)合位點(diǎn)

7BV2是由nsp12－nsp7－nsp8復(fù)合物和模板引物RNA組成的復(fù)雜復(fù)合物，在處理蛋白時(shí)僅保留nsp12肽鏈。為了偵測(cè)nsp12潛在的結(jié)合位點(diǎn)，使用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在線平臺(tái)FTmap（http：//ftmap.bu.edu/login.php）和Maestro中的site map板塊偵測(cè)目標(biāo)蛋白潛在的結(jié)合口袋。采用一致性高的預(yù)測(cè)結(jié)果，以提升靶點(diǎn)結(jié)合口袋預(yù)測(cè)的可靠性。其中FTmap在線平臺(tái)產(chǎn)出可結(jié)合小分子抑制劑的潛在活性口袋，并進(jìn)行打分排序，而Maestro軟件中的site map可在預(yù)測(cè)小分子結(jié)合口袋并打分排序的同時(shí)，給出各活性口袋相關(guān)氫鍵供受體及疏水空間等信息。本研究中，Maestro軟件的site map及FTmap給出的預(yù)測(cè)結(jié)果一致性高，其中打分排名靠前的位點(diǎn)依次為位點(diǎn)1、位點(diǎn)2、位點(diǎn)3（見(jiàn)圖3）。

圖3 FTmap及Maestro預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)A.Site 1 B.Site 2 C.Site 3Fig.3 Predicted binding sites by FTmap and Maestro

其中，結(jié)合位點(diǎn)1為本研究使用的高通量虛擬篩選位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)2為底物位點(diǎn)，也是瑞德西韋活性代謝物的結(jié)合位點(diǎn)。位點(diǎn)1、位點(diǎn)3未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中基于FTmap和Maestro一致性預(yù)測(cè)的結(jié)果，選擇排名優(yōu)先的位點(diǎn)1進(jìn)行高通量篩選。后續(xù)研究中，計(jì)劃探討位點(diǎn)3作為靶點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)的可能性。

當(dāng)圖1中的位點(diǎn)確定后，以Maestro中Grid Generation模塊，基于預(yù)測(cè)位點(diǎn)1中心處氨基酸殘基為中心，建立邊長(zhǎng)為20?的網(wǎng)格，作為活性口袋對(duì)接中心，對(duì)接網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4。

圖4 以預(yù)測(cè)位點(diǎn)為中心的對(duì)接網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The docking netwokd established with the predicted sites as the center

結(jié)果顯示，存在2個(gè)主要結(jié)合位點(diǎn)，一是瑞德西韋代謝活性物結(jié)合位點(diǎn)，組成口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基為L(zhǎng)YS545，SER682，ASP623，THR687，SER759，ASP760，ASN691等；二是靠近此位點(diǎn)邊上的結(jié)合位點(diǎn)（潛在變構(gòu)位點(diǎn)），組成該口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基為PHE165，PRO169，ASP170，LEU172，ARG173，THR246，LEU247，ARG249，TYR265，THR319，PRO323，THR324，ARG349，LEU389，ASP390，LYS391，THR393，THR394，PHE396，ARG457，TYR458，LEU460，PRO461，THR462，PRO677等。2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的位置見(jiàn)圖5，本研究中主要闡述潛在的變構(gòu)位點(diǎn)。

圖5 RdRp蛋白上2個(gè)對(duì)接位點(diǎn)Fig.5 Two docking sites on RdRp protein

1.2.3 化合物庫(kù)選擇

最新（截至本文投稿時(shí)）幾篇刊載于Science和Nature的文章指出，抗SARS－CoV－2的基本都是擬肽類(lèi)化合物[4，7－8]。借助Npatla公司提供的化合物庫(kù)建立了包含大量肽樣化合物的以細(xì)菌和真菌的代謝產(chǎn)物為主體的化合物庫(kù)，借助計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）方法，對(duì)RdRp抑制劑進(jìn)行了分子對(duì)接研究。

1.2.4 化合物結(jié)構(gòu)處理

運(yùn)用軟件中的“Ligprep”模塊對(duì)化合物分子進(jìn)行優(yōu)化處理。

1.2.5 分子對(duì)接

采用“Receptor Grid Generation”模塊，以潛在變構(gòu)位點(diǎn)為中心生成格點(diǎn)文件。以7BV2作為剛性受體，各配體分子作為柔性配體，進(jìn)行半柔性對(duì)接。采用“Ligand Docking”模塊進(jìn)行高通量虛擬篩選，以docking score打分值作為初步篩選條件，再對(duì)打分靠前的化合物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接。

初篩以Maestro軟件中提供的HTVS對(duì)接方式進(jìn)行，該方法篩選速率較快，同時(shí)具備一定的對(duì)接精度。之后對(duì)于打分排序靠前的化合物，通過(guò)Maestro軟件中的標(biāo)準(zhǔn)模式（SP）對(duì)接進(jìn)行確認(rèn)。因基于高通量篩選數(shù)據(jù)龐大，故未在文中一一列舉。

2 結(jié)果

AR00455小分子表現(xiàn)出極高的親和力，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖6。化合物AR00455是一種細(xì)菌素，最早是由從魚(yú)內(nèi)臟中分離出來(lái)的乳酸菌（肉食桿菌屬V41）的代謝產(chǎn)物中分離得到[9]。該化合物docking score打分值為－11.101 kcal/mol，能完美占據(jù)RdRp潛在的變構(gòu)位點(diǎn)。AR00455小分子的Lys2－Tyr3氨基酸片段伸向活性位點(diǎn)深處，其中Lys2被PHE165，PRO169，ARG457，TYR458等氨基酸殘基包圍，Tyr3被THR246，LEU247，LEU460，PRO461，THR462等氨基酸殘基包圍；近肽鏈末端的Tyr9片段處于由LEU389，ASP390，LYS391，THR393等殘基構(gòu)成的口袋中；Tyr4－Gly5－Asn6－Gly7－Val8肽鏈片段折疊在空腔表面；肽鏈末端的特殊含硫結(jié)構(gòu)片段處于由THR393，THR394，PHE396等殘基構(gòu)成的口袋中（見(jiàn)圖7）。

圖6 AK00455小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structure of AK00455 small-molecule

圖7 AR00455抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和口袋模型Fig.7 Chemical structure and pocket model of AR00455 inhibitor

AR00455與RdRp蛋白復(fù)合物單個(gè)氨基酸殘基能量分解分項(xiàng)值見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，配體與大多數(shù)氨基酸殘基之間的范德華力差異不大，范德華相互作用能主要由A323，A319，A461，A460，A249，A396等殘基參與。A665和A350的靜電能項(xiàng)是負(fù)值，且值較大，有助于配體和受體相互作用，其余尤其是A676，A457，A349的靜電相互作用能對(duì)復(fù)合物的結(jié)合有阻礙作用。

3 討論

對(duì)于COVID－19，目前仍無(wú)特效藥，治療藥物的選擇多基于SARS或其他流感病毒的治療經(jīng)驗(yàn)，安全、有效和經(jīng)濟(jì)的抗病毒藥物研發(fā)迫在眉睫[10]。

SARS－CoV－2靶標(biāo)眾多，研發(fā)人員目前研究較多的靶點(diǎn)是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）、主蛋白酶（Mpro）3CL和RdRp。SARS－CoV－2識(shí)別宿主細(xì)胞是通過(guò)S蛋白的受體結(jié)合區(qū)（RBD）與宿主表面特異表達(dá)的受體分子的識(shí)別來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究表明，ACE2為CoV S蛋白的受體，在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞前S蛋白會(huì)被宿主表面蛋白酶TMPRSS2水解成S1和S2兩段，S1負(fù)責(zé)識(shí)別ACE2，S2負(fù)責(zé)融合宿主細(xì)胞[11]。所以在CoV入侵過(guò)程中，寄主細(xì)胞表面的ACE2和TMPRSS2蛋白扮演了重要角色。但ACE2在人體內(nèi)有同源性蛋白，且廣泛分布于心臟、腎臟、睪丸、脂肪組織、腦組織、血管平滑肌細(xì)胞、胃腸道等，在治療過(guò)程中，抑制ACE2蛋白類(lèi)藥物可能會(huì)對(duì)人體造成不可估計(jì)的副作用[12]。

Mpro屬半胱氨酸水解酶，是CoV的主要蛋白酶之一，負(fù)責(zé)切割病毒基因組翻譯的蛋白前體，得到多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，由這些非結(jié)構(gòu)蛋白組裝形成病毒的復(fù)制－轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體，病毒才能完成正常的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，是抗CoV藥物設(shè)計(jì)過(guò)程中的重要靶標(biāo)[13]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)此做了大量研究。[14]團(tuán)隊(duì)篩選發(fā)現(xiàn)，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的硫醇反應(yīng)藥物中，抗酒精藥物戒酒硫及其巰基反應(yīng)衍生物與靶點(diǎn)蛋白3CL pro親和力最高，且與CYS145發(fā)生氫鍵作用，具有病毒臨床治療潛力。朱云鵬[15]通過(guò)體外抑制活性試驗(yàn)篩選獲得5個(gè)抑制SARS－CoV主蛋白酶活性較強(qiáng)的化合物，并運(yùn)用抑制動(dòng)力學(xué)研究及分子對(duì)接等方法探討其抑制機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)化合物能與SARS－CoV－Mpro催化活性中心的Cys－145形成共價(jià)鍵，為不可逆抑制劑，1個(gè)化合物能與SARS－CoVMpro的Asn－142，Gly－143，Gln－189形成氫鍵，以非共價(jià)鍵的方式與蛋白結(jié)合。劉妍如等[16]運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)模擬預(yù)測(cè)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中藥成分對(duì)SARS－CoV－2 3CL水解酶的作用，共篩選得到60個(gè)化合物，且所篩選化合物主要?dú)w屬藥材為甘草、桑白皮、滿山紅、虎杖、車(chē)前草等。馬青云等[17]以3CL水解酶為靶蛋白，篩選出66個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)良好的天然小分子抑制劑，優(yōu)選出12味中藥單味藥，2個(gè)中藥藥對(duì)及12個(gè)中藥處方作為抗CoV的候選方案。

本研究基于高通量虛擬篩選技術(shù)，對(duì)擬肽化合物庫(kù)進(jìn)行了關(guān)于SARS－CoV－2 RdRp抑制劑的初步虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)分子AR00455與RdRp潛在變構(gòu)位點(diǎn)具有高度親和力，結(jié)合能為－11.101 kcal/mol，潛在抑制活性較強(qiáng)，并給出了AR00455分子與RdRp的結(jié)合模型。通過(guò)能量貢獻(xiàn)值分析發(fā)現(xiàn)，SARS－CoV－2 RdRp變構(gòu)活性位點(diǎn)口袋中的A323，A319，A461，A460，A249，A396，A665，A350等關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)其與AR00455分子的相互作用力貢獻(xiàn)較大，這為后期基于此位點(diǎn)的擬肽小分子結(jié)構(gòu)改造提供了方向和理論參考。

鑒于AR00455分子中各氨基酸殘基化學(xué)性質(zhì)的差異，可對(duì)其進(jìn)行以下修飾：一方面，肽鏈中Thr1和Asn6為極性不帶電氨基酸，可替換成同為極性不帶電氨基酸的Ser，Thr，Asn，Gln等；Lys2為帶正電氨基酸，可替換成Arg或His等帶正電氨基酸；Tyr3，Tyr4，Val8，Tyr9為非極性氨基酸，可替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等非極性氨基酸。

另一方面，活性口袋處Asp170是極性帶負(fù)電氨基酸殘基，最靠近肽鏈Thr1片段，可考慮將Thr1替換成Arg，His，Lys等極性帶正電氨基酸；Tyr458是非極性氨基酸殘基，最靠近肽鏈Lys2片段，可考慮將Lys2替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等非極性氨基酸；THR246，LEU247，LEU460，THR462等氨基酸殘基包圍著肽鏈片段Tyr3，可將Tyr3替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Trp等非極性氨基酸或Ser，Thr，Asn，Gln等極性不帶電氨基酸；LEU460是非極性氨基酸殘基，最靠近Tyr4肽鏈片段，可將Tyr4替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Trp等非極性氨基酸；Gly5－Asn6－Gly7肽鏈片段最靠近Tyr265非極性氨基酸殘基，可將Gly5－Asn6－Gly7肽鏈片段替換成由Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等組成；Thr324是極性不帶電氨基酸，最靠近Val8肽鏈片段，可將Val8替換成Ser，Thr，Asn，Gln等極性不帶電氨基酸；LEU389是非極性氨基酸，LYS391是極性帶正電氨基酸，二者都靠近Tyr9肽鏈片段，可將Thr9替換成Ala，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Tyr，Trp等非極性氨基酸，或Arg和His等極性帶負(fù)電氨基酸。

AR00455分子是乳酸菌代謝產(chǎn)物中分離得到的一種細(xì)菌素，后續(xù)可多關(guān)注該類(lèi)肽類(lèi)化合物，以尋找新的有價(jià)值的活性小分子。鑒于虛擬篩選結(jié)果的局限性，后期還需通過(guò)體外和體內(nèi)等活性試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本研究結(jié)果，以期為擬肽類(lèi)藥物的研發(fā)提供更為準(zhǔn)確、可靠的試驗(yàn)依據(jù)。