曹瑾,郝靜芳,田川,童路遙,張紅葵,楊路,許素玲
圓錐角膜(KC)是一種以角膜擴(kuò)張、中央?yún)^(qū)角膜基質(zhì)變薄、呈圓錐形突起及高度不規(guī)則近視散光為特征的角膜擴(kuò)張性疾病[1]。這種疾病受遺傳、環(huán)境及種族等因素影響,患病率在1/2 000~1/375[2-4]。早期KC患者可通過框架眼鏡和配戴角膜接觸鏡矯正視力,晚期患者只能通過手術(shù)如角膜交聯(lián)術(shù)、角膜移植術(shù)等才能恢復(fù)視力[5]。因此,KC發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)早期診斷和及時(shí)治療具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)方法篩選并分析KC組織與正常角膜組織進(jìn)行差異表達(dá)基因,以期闡明KC發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制,報(bào)道如下。
1.1 數(shù)據(jù)獲取 從GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫中下載RNA-Seq數(shù)據(jù)集(GSE77938),該數(shù)據(jù)集基于GPL18460共有50個(gè)樣本,其中包括正常角膜組織、KC組織樣本各25例。
1.2 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因篩選將GSE77938的RNAseq測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化處理后,利用R語言limma包分析差異表達(dá)基因,篩選符合條件的差異表達(dá)基因(DEGs),并繪制基因表達(dá)火山圖,DEGs的篩選條件為|log FC|>1.5且adjP value<0.05。
1.3 差異表達(dá)基因富集分析 通過R語言的Cluster Profiler包對(duì)篩選出的DEGs進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析,P<0.05為富集的篩選閾值。
1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)建立與核心基因篩選 將所有DEGs導(dǎo)入STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/),評(píng)估蛋白質(zhì)之間的功能相互作用。應(yīng)用Cytoscape對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化,進(jìn)而篩選核心基因。
2.1 差異表達(dá)基因 對(duì)KC及正常角膜組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,并通過R軟件篩選得到394個(gè)差異表達(dá)基因。與正常組織相比,KC組織中有54個(gè)基因上調(diào),340個(gè)基因下調(diào)。見圖1。其中前10個(gè)上調(diào)基因分別是KLHL14、COL21A1、CTD-2008P7.9、BTBD16、SCN3A、SH3GL3、RP11-255H23.2、CYP26A1、CD36、RNA5SP487。前10個(gè)下調(diào)基因分別是CDH11、PTPRG、PDPN、PRICKLE1、CYP24A1、PRSS23、PLOD2、C1S、HLA-DPA1、C1R。
圖1 差異表達(dá)基因火山圖
2.2 GO富集分析 主要分為細(xì)胞組成、分子功能及生物學(xué)過程等。在細(xì)胞組成中,DEGs主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)膠原、主要組織相容性復(fù)合體等;在分子功能中,主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分、提供抗拉強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組分、血小板源生長因子結(jié)合等;在生物學(xué)過程中,主要富集在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、干擾素反應(yīng)等。見圖2。
圖2 差異表達(dá)基因GO和KEGG部分分析結(jié)果
2.3 KEGG信號(hào)通路分析 差異基因主要富集在金黃色葡萄球菌通路、利什曼通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路,P值最小的前10項(xiàng)富集信號(hào)通路見圖2。
2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵基因 通過STRING網(wǎng)站構(gòu)建DEGs的蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò),將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape中進(jìn)行可視化分析,篩選分值最高的10個(gè)差異基因?yàn)楹诵幕颍謩e為HLA-DRA、HLA-C、HLA-DRB5、HLA-F、HLADQB1、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLAB、HLA-DPA1、HLA-DQA1(圖3)。
圖3 PPI分析后使用Cytoscape篩選分值最高的10個(gè)差異基因
KC是一種常見的非炎癥性的角膜擴(kuò)張性疾病,以中央角膜變薄、角膜瘢痕形成、角膜突出和不規(guī)則近視散光為特征,可導(dǎo)致明顯的視力損害。研究顯示KC與膠原發(fā)育障礙、內(nèi)分泌與細(xì)胞代謝紊亂、免疫缺陷等相關(guān),它的發(fā)病機(jī)制與遺傳和環(huán)境有關(guān)[6]。
本研究通過對(duì)KC的RNA-Seq數(shù)據(jù)集的差異分析,獲得394個(gè)差異基因,其中54個(gè)上調(diào)基因,340個(gè)下調(diào)基因。GO富集分析表明差異基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)、膠原等細(xì)胞組分,此外還參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物進(jìn)程密切相關(guān)。細(xì)胞外基質(zhì)是角膜的主要結(jié)構(gòu)成分,賦予角膜特殊的生理功能[7]。在KC中,參與細(xì)胞外基質(zhì)合成的基因異常,引起角膜細(xì)胞與基質(zhì)的黏附作用減弱,連接間質(zhì)的膠原纖維及其他細(xì)胞外基質(zhì)功能降低,阻礙其與角膜基質(zhì)膠原結(jié)合,進(jìn)而影響正常角膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致角膜的穩(wěn)固性下降,這可能是角膜圓錐狀突起形成的主要原因之一[8]。
本研究發(fā)現(xiàn),CDH11在KC中表達(dá)明顯降低。有研究表明CDH11通過-catenin調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路[9]。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,與角膜疾病、視網(wǎng)膜病變等病理過程相關(guān)[10-11]。而有關(guān)CDH11在KC中發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。KEGG分析結(jié)果顯示差異基因主要參與金黃色葡萄球菌通路、利什曼通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等信號(hào)通路,3條通路均涉及T細(xì)胞受體信號(hào)調(diào)控。這提示T細(xì)胞受體信號(hào)調(diào)控過程對(duì)KC生物學(xué)行為的影響有利于理解其免疫學(xué)過程,為基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)掘出新的更有針對(duì)性的免疫療法提供參考。為了進(jìn)一步研究差異基因?qū)C的影響,對(duì)差異基因進(jìn)行PPI構(gòu)建及篩選后獲得HLA-DRA、HLA-C、HLA-DRB5、HLAF、HLA-DQB1、HLA-DQA2、HLADRB1、HLA-B、HLA-DPA1、HLADQA1等核心基因,揭示人白細(xì)胞抗原可能是診斷KC的新型生物標(biāo)志物。
綜上所述,細(xì)胞外基質(zhì)、T細(xì)胞受體信號(hào)調(diào)控等在KC發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用,本課題組將采用細(xì)胞模型對(duì)參與基因進(jìn)一步深入研究。