莊丹燕，王飛，潘婕文，潘小莉，潘澍青，陳志央，李海波

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（G6PDD）是一種因編碼G6PD酶的DNA突變使該酶結(jié)構(gòu)或其活性發(fā)生改變，最終影響紅細(xì)胞自身抗氧化能力減弱，易被破壞引發(fā)溶血黃疸等一系列癥狀的X連鎖不完全顯性遺傳病[1]。G6PD基因突變類(lèi)型和頻率因地區(qū)種族人群差異較大，常見(jiàn)于非洲熱帶、東南亞、地中海和中東區(qū)域[2]，我國(guó)則以南方地區(qū)為主[3]。G6PD酶法檢測(cè)受性別、溫度等影響較大[4-5]。本研究針對(duì)2018年寧波地區(qū)出生的新生兒，行G6PD缺乏癥酶法篩查及基因診斷，以評(píng)估G6PD缺乏癥在寧波地區(qū)的發(fā)病情況，明確寧波地區(qū)人群的G6PD基因突變類(lèi)型和頻率，同時(shí)分析基因型與酶活性相關(guān)性，為寧波市篩查中心制定本地區(qū)最佳的G6PD缺乏癥篩查及確診方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集寧波市2018年出生的新生兒78 338名，每例新生兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)自愿參加免費(fèi)新生兒疾病篩查。采其足跟血制成干血斑用于篩查，篩查陽(yáng)性樣本（酶活性≤2.6 U/g Hb）進(jìn)行基因確診，同一篩查時(shí)間段內(nèi)酶活性介于2.6～3.0 U/g Hb的女性樣本也納入基因檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 G6PD初篩實(shí)驗(yàn) 采用Wallac 1420 VictorTM2及配套G6PD熒光分析試劑盒對(duì)新生兒干血斑進(jìn)行初篩，試驗(yàn)步驟和結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.2.2 G6PD/6GPD生化比值檢測(cè) 篩查可疑陽(yáng)性的患兒召回抽取患兒抗凝血，采用G6PD/6GPD試劑盒（廣州米基）進(jìn)行確診，G6PD/6GPD＜1視為確診G6PD缺乏。

1.2.3 G6PD基因檢測(cè) 采用Lab-Aid824核酸提取儀（廈門(mén)致善）提取干血斑標(biāo)本中基因組DNA，用SLAN-96S實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（上海宏石）進(jìn)行多色探針熒光PCR熔解曲線(xiàn)分析。通過(guò)比較待檢標(biāo)本與野生型對(duì)照的熔解峰之間熔點(diǎn)（Tm值）的差異判斷標(biāo)本是否發(fā)生突變及突變的類(lèi)型。如果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)突變，則對(duì)G6PD編碼外顯子進(jìn)行Sanger測(cè)序（NM_001042351.1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 寧波地區(qū)G6PD基因突變類(lèi)型和頻率 78 338例新生兒G6PD篩查中，酶活性≤2.6 U/g Hb的陽(yáng)性例數(shù)405例，介于2.6～3.0 U/g Hb之間的女性95例，共500例樣本納入基因檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果220例未見(jiàn)突變，280例檢出不同位點(diǎn)突變，以1388G＞A突變占比最多（86例，占30.71%，含72例純合突變和14例雜合突變），其次為1376G＞T（77例，占27.50%，含55例純合突變和22例雜合突變）。其中c.1375C＞T、c.350C＞T兩個(gè)突變，MMCA檢測(cè)結(jié)果為未知基因，Sanger測(cè)序后發(fā)現(xiàn)為這兩個(gè)突變。見(jiàn)表1、封三彩圖7。

表1 不同基因突變位點(diǎn)和頻率統(tǒng)計(jì)

2.2 基因突變攜帶率在不同G6PD酶活性區(qū)間分布情況 經(jīng)基因檢測(cè)的500例樣本，其中男290例，女210例。當(dāng)G6PD酶活＞2.4 U/g Hb時(shí)，男性樣本突變攜帶率＜20%；而女性高達(dá)20%～50%。見(jiàn)封三彩圖8。

2.3 G6PD基因型與酶活相關(guān)性 比較5種最常見(jiàn)基因突變位點(diǎn)樣本G6PD酶活性差異，不同基因突變位點(diǎn)樣本G6PD初篩濃度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=8.713，P＜0.05）；95A＞G突變類(lèi)型G6PD初篩＞2.6 U/g Hb的比例均高于1376G＞T（2=5.377，P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同基因突變位點(diǎn)樣本G6PD初篩值比較 例（%）

3 討論

3.1 G6PD基因突變類(lèi)型和頻率G6PD是一種細(xì)胞溶質(zhì)酶，在胞漿內(nèi)和細(xì)胞膜上均有分布，幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都含有G6PD。人類(lèi)編碼G6PD酶的DNA序列由13個(gè)外顯子、12個(gè)內(nèi)含子組成，位于X染色體端粒附近，其完整序列長(zhǎng)達(dá)16.2Kb[6]。G6PD基因突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?世界范圍已報(bào)道400多種突變[7]。我國(guó)以c.1388G＞A、c.1376G＞T及c.95A＞G突變?yōu)橹鱗8]。本研究發(fā)現(xiàn)，寧波地區(qū)最常見(jiàn)的前3位基因突變類(lèi)型為c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.1024C＞T，共占75%；另外c.95A＞G、c.871G＞A和c.392G＞T基因在寧波地區(qū)也有較高發(fā)生率，分別占10.36%、5.36%及3.21%，與海南省報(bào)道的相似[9]。雖然本研究與溫州地區(qū)報(bào)道的c.1376G＞T、c.1388G＞A和c.1024C＞T前3位略有不同[10]，但前6位主要突變類(lèi)型還是基本一致的。本研究還發(fā)現(xiàn)3例復(fù)合突變：1360C＞T與1388G＞A、95A＞G與1024C＞T、95A＞G與1388G＞A。這3例復(fù)合突變均發(fā)生于G6PD活性缺乏的女性，這提示該突變可能是雙雜合子，需進(jìn)一步需完善父母基因檢測(cè)結(jié)合家系判定結(jié)果。

另外，在初篩陽(yáng)性樣本中檢出兩例未知突變，經(jīng)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)是c.1375C＞T、c.350C＞T突變各1例，均未見(jiàn)報(bào)道。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)，c.350C＞T突變?yōu)榈?號(hào)外顯子350位置C替換成T，導(dǎo)致氨基酸功能發(fā)生改變，絲氨酸轉(zhuǎn)換成苯丙氨酸；c.1375C＞T突變?yōu)榈?3號(hào)外顯子1375位置C替換成T，精氨酸轉(zhuǎn)換成半胱氨酸，均為錯(cuò)義突變。

3.2 G6PD基因型與酶活相關(guān)性G6PD缺乏癥的遺傳方式是一種伴性不完全顯性遺傳，男性患兒只有半合子，其多表現(xiàn)為酶活性顯著缺乏，而女性因?yàn)橛袃蓷lX染色體，故可有純合子和雜合子2種。純合子表現(xiàn)為酶活性嚴(yán)重缺乏，雜合子因X染色體存在隨機(jī)失活現(xiàn)象，體內(nèi)可同時(shí)存在酶缺乏和正常兩種紅細(xì)胞，且兩者分布并不均[11]，可表現(xiàn)為酶活性正?；騼H輕度降低。本研究顯示，G6PD酶活＞2.4 U/g Hb時(shí)，男性樣本突變攜帶率＜20%，而女性高達(dá)20%～50%?？梢?jiàn)，G6PD基因有突變攜帶的男性酶活性分布在2.4 U/g Hb以下居多；女性酶活性高至3.0 U/g Hb突變攜帶率才降至20%左右。假如不同性別使用同一酶活切值去界定陽(yáng)性人群，則會(huì)導(dǎo)致絕大多數(shù)女性雜合子漏篩或男性出現(xiàn)過(guò)多假陽(yáng)性，因此需要對(duì)不同性別分設(shè)不同陽(yáng)性截?cái)嘀怠?/p>

本研究結(jié)果顯示，871G＞A和95A＞G突變類(lèi)型，其G6PD初篩＞2.6 U/g Hb的比例顯著高于1376G＞T，這說(shuō)明該種突變相對(duì)1376G＞T，酶活性下降程度較低；而其他4種位點(diǎn)突變酶活性下降程度較高，后續(xù)可進(jìn)一步進(jìn)行挖掘探討。

3.3 寧波地區(qū)篩查診斷模式探討 由于G6PD缺乏癥不完全顯性的特性及突變分布的差異，不同省份對(duì)G6PD缺乏癥的檢出存在差異。本研究結(jié)果表明，寧波的G6PD新生兒人群突變攜帶率達(dá)0.36%（280/78338），低于海南、廣東等高發(fā)地區(qū)[10,12]，與本省溫州地區(qū)相似[9]，略高于溫州的0.3%。寧波地區(qū)處于長(zhǎng)江以南，隨著近年城市化進(jìn)程加快，人口流動(dòng)日益頻繁等因素，本地區(qū)的G6PD發(fā)病也確實(shí)不容忽視。G6PD缺乏癥一旦發(fā)病病情嚴(yán)重，只能對(duì)癥治療，通過(guò)新生兒篩查及基因診斷可起到早診斷早預(yù)防的效果，并且對(duì)女性雜合子的檢出可進(jìn)一步指導(dǎo)生育。對(duì)于G6PD缺乏癥的篩查診斷防治本研究提供了一定依據(jù)，也為后續(xù)基因型和表型相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。