徐家佳，李菁菁，李延巖，李文政，管明婧，金宇，李林，張承武*，王孝峰，張曉宇，周順，曹蕓*

1 安徽中煙工業(yè)責(zé)任有限公司，安徽省合肥市高新區(qū)天達(dá)路9號(hào) 230088；

2 南京工業(yè)大學(xué)，先進(jìn)材料研究院，江蘇省南京市浦口區(qū)浦珠南路30號(hào) 211816

帕金森?。≒arkinson’s disease, PD）是一種多發(fā)于中老年人、以運(yùn)動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，最主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元變性、死亡[1-4]。PD作為第二高發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在世界范圍內(nèi)，65歲以上人群中有1%～2%的人受到PD的影響[5]；隨著人口老齡化的快速發(fā)展，我國(guó)PD患者的數(shù)量也將相應(yīng)地大大增加，據(jù)估計(jì)到2050年我國(guó)的PD患者將達(dá)到1000萬(wàn)[6]。PD病程長(zhǎng)、致殘率高，但目前尚缺乏有效的治療手段，PD不僅嚴(yán)重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量，且已經(jīng)成為影響我國(guó)人口健康水平、阻礙經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展的社會(huì)問(wèn)題。

大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，吸煙與PD的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，吸煙人群PD的發(fā)病率顯著低于非吸煙人群[7-10]，提示煙草具有對(duì)抗PD的作用，但其中的機(jī)制并不清楚。煙堿（又稱尼古丁，Nicotine）是煙草的重要成分，在離體培養(yǎng)的細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究結(jié)果表明，煙堿是煙草中對(duì)多巴胺能神經(jīng)元起保護(hù)作用的關(guān)鍵分子[11-13]。煙堿對(duì)抗PD的分子機(jī)制已有眾多報(bào)道，目前主要的觀點(diǎn)認(rèn)為，煙堿是通過(guò)結(jié)合煙堿型乙酰膽堿受體發(fā)揮作用，主要的分子通路為煙堿結(jié)合到受體后，激活細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，后者又激活下游的眾多信號(hào)分子，包括蛋白激酶A（PKA）、細(xì)胞分裂原活化蛋白激酶（ERK）、鈣調(diào)蛋白（CaM）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等，從而減少神經(jīng)元的凋亡，起到對(duì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用[14-17]。但這一觀點(diǎn)也受到了一定質(zhì)疑，例如，煙堿型乙酰膽堿受體主要表達(dá)于神經(jīng)元，而煙堿對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞同樣具有調(diào)控作用[18]；另外，如果按上述觀點(diǎn)，鈣離子是煙堿與煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合后發(fā)揮作用的重要信使分子，鈣離子抑制劑理論上可完全阻斷煙堿的保護(hù)作用，但這點(diǎn)并沒(méi)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持。因此，煙堿對(duì)于PD的對(duì)抗作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

單胺氧化酶-B（Monoamine Oxidase B, MAO-B）是機(jī)體內(nèi)降解多巴胺的關(guān)鍵酶，主要表達(dá)于線粒體外膜。大量研究結(jié)果表明，MAO-B在PD患者過(guò)表達(dá)，MAO-B不僅加劇多巴胺的缺乏，且在降解多巴胺的過(guò)程中發(fā)生自身氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫；也有研究表明其代謝會(huì)激活線粒體電子傳遞鏈的活性，是多巴胺能神經(jīng)元死亡的誘導(dǎo)因素[19-20]。MAO-B抑制劑包括selegiline、rasagiline、safinamide等 是FDA批 準(zhǔn)的治療PD的臨床一線藥物[21-23]，此外Pargyline作為MAO-B特異性不可逆抑制劑，可影響酪胺代謝引起血壓降低，常作為降壓藥使用[24]。目前已有研究證實(shí)吸煙者腦內(nèi)的MAO-B含量顯著低于非吸煙者，這或許是煙堿產(chǎn)生的抑制作用[25]。進(jìn)而通過(guò)分子結(jié)構(gòu)比較分析，發(fā)現(xiàn)煙堿的分子結(jié)構(gòu)和已有的數(shù)十種MAO-B的抑制劑具有相似性，均屬于香豆素衍生物或（雜）芳酰胺類化合物[26]，由此推測(cè)煙堿或可通過(guò)抑制MAO-B活性對(duì)抗PD。

本文利用小分子與蛋白互作結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)，分析煙堿和MAO-B的結(jié)合位點(diǎn)，并在MPTP誘導(dǎo)的細(xì)胞PD模型及parkin基因敲除的果蠅PD模型中[27]研究煙堿對(duì)抗PD的作用。本研究有助于明確吸煙對(duì)抗PD的分子機(jī)制，有利于PD治療方案的拓展，同時(shí)為更好地綜合利用我國(guó)豐富的煙草資源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

煙堿（Nicotine），MPTP hydrochloride (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride)，重組單胺氧化酶B (MAO-B, Monoamine Oxidase B human )，DMSO 購(gòu)于sigma公司；MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazol-3-ium bromide）購(gòu)于源培生物；Amplex Red Monoamine Oxidative Assay Kit，Pargyline hydrochloride，PVDF膜購(gòu)于Thermofisher；NAD+試劑盒，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，ATP檢測(cè)試劑盒，PMSF，RIPA裂解液購(gòu)于碧云天；多巴胺含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于金霖生物；電泳凝膠配制試劑盒購(gòu)于雅酶；一抗包括 JNK，P-JNK，C-PARP，ERK，TOM20，MAO-B，二抗包括 HRP anti mouse，HRP anti Rabbit，均購(gòu)自CST；DMEM，F(xiàn)BS胎牛血清購(gòu)自BI；果蠅培養(yǎng)基，Parkin null果蠅由新加坡國(guó)立神經(jīng)研究所贈(zèng)予。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和條件

1.2.1 小分子-蛋白相互作用理論模型計(jì)算方法

利用Grid軟件構(gòu)建MAO-B蛋白具有FAD活性空腔的除水蛋白模型（使用來(lái)自于PDB官網(wǎng)（http://www1.rcsb.org/）的MAO-B蛋白結(jié)構(gòu)，編碼PDB code: 2BK3, 2VRL and 4A7A），利用AutoDock（1.5.6）軟件將煙堿和Pargyline（Pargyline hydrochloride）結(jié)構(gòu)導(dǎo)入作為配體。將蛋白模型和配體結(jié)構(gòu)均處理為.pdbqt格式，在Grid軟件中確定蛋白活性空腔的三維box，長(zhǎng)寬高數(shù)值為42/52/46，中心位置為36.739/31.292/12.149，同時(shí)確保配體的所有單鍵均可旋轉(zhuǎn)。在Pymol（2.3.2）軟件中確定結(jié)合空間，進(jìn)行cmd演算，計(jì)算出配體對(duì)蛋白的能量值，能量最低的為最穩(wěn)定構(gòu)象。在模型中使用的MAO-B蛋白模型活性空腔的氨基酸序列為 Tyr60, Gln65, Val82, Glu84,Leu88, Leu171, Cys172, Ile198, Ile199, Ser200, Thr201,Glu207, Thr314, Ile316, Tyr326, Leu328, Met341,Phe343, Tyr398 and Tyr435，煙堿與Pargyline的活性位點(diǎn)均為N。

1.2.2 體外純蛋白抑制率檢測(cè)

將煙堿均勻稀釋于PBS溶液中分別配制成1μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L的 溶 液 待 用。配制Pargyline的10 μmol/L的PBS溶液待用。配 制MAO-B蛋 白50 μg/mL的PBS溶 液 待 用。根 據(jù)Amplex Red Monoamine Oxidase Assay Kit（Thermofisher Invitrogen）提供的檢測(cè)試劑和檢測(cè)方法，將MAO-B底物 benzylamine與馬血清以及amplex red探針配制成工作液待用。在buffer溶液中分別加入煙堿/ Pargyline、MAO-B蛋白，使煙堿最終濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L，Pargyline的最終濃度為1 μmol/L，MAO-B的最終濃度為10μg/mL，將混合溶液置于37℃的搖床上振蕩1 h后，等體積加入工作液，繼續(xù)在37℃搖床振蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至黑色384孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。利用酶標(biāo)儀（Synergy HTX）檢測(cè)各組溶液的熒光強(qiáng)度。檢測(cè)條件為激發(fā)光波長(zhǎng)542 nm，接收發(fā)射波長(zhǎng)570～700 nm。該試劑盒檢測(cè)原理為MAO-B會(huì)與其底物benzylamine反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，amplex red探針可檢測(cè)過(guò)氧化氫含量轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)。當(dāng)溶液中含有抑制MAO-B活性的物質(zhì)存在時(shí)，產(chǎn)生的過(guò)氧化氫減少，熒光信號(hào)減弱，即可通過(guò)反應(yīng)后溶液的熒光強(qiáng)度間接判斷MAO-B蛋白活性的抑制率。

1.2.3 MTT法檢測(cè)藥物毒性和細(xì)胞活力

將3×104個(gè)細(xì)胞均勻接種于96孔板中，共6行11列，每列設(shè)為1組。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，每組加入含有不同濃度神經(jīng)毒性藥物MPTP的培養(yǎng)基，最終濃度分 別 為0、0.1、1、10、25、50、100、250、500、1000 μmol/L，另設(shè)一列空白組。每組所含DMSO含量均為0.1%，孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL,避光孵育4 h，出現(xiàn)藍(lán)紫色結(jié)晶。輕輕吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO溶液，用酶標(biāo)儀振蕩1 min使結(jié)晶完全溶解分散均勻后檢測(cè)波長(zhǎng)452 nm處的吸光度，按以下公式計(jì)算每組的細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=（A實(shí)驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）

細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中將毒性物質(zhì)替換為不同濃度的煙堿，檢測(cè)方法同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞中 NAD+/NADH 0水平檢測(cè)

將1.2×106個(gè)細(xì)胞均勻接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%左右時(shí)，每孔加入含有相同濃度MPTP（100 μmol/L），不同濃度煙堿的培養(yǎng)基，最終濃度分別為0、0.1、1、10、100 μmol/L，Pargyline作為陽(yáng)性對(duì)照藥物濃度為10 μmol/L。24 h后，收集各組細(xì)胞，用NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒（碧云天）提供的試劑和方法處理細(xì)胞。具體為，每孔用200μL酸性提取液在冰上裂解細(xì)胞，10000 g 4℃離心10 min，取上清，加入等體積堿性提取液，充分混合后10000 g 4℃離心10 min，取上清10 μL用于蛋白濃度測(cè)定（BCA蛋白濃度試劑盒），另取50 μL上清分別按序加入試劑盒提供的檢測(cè)試劑，混勻后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度，按以下公式計(jì)算每組細(xì)胞中NAD+含量：

NAD+含量（nmol/mg）=（A測(cè)定-A對(duì)照-0.099）×V50/（V10×Cprotein）

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞中ATP水平檢測(cè)

細(xì)胞接種及給藥方式同1.2.4，每孔用200 μL ATP裂解液冰上充分裂解細(xì)胞后12000 g 4℃離心15 min，取上清10 μL檢測(cè)蛋白濃度，收集剩余得到樣品液。將ATP標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成5 μmol/L，1 μmol/L，0.5 μmol/L，0.1 μmol/L，0.05 μmol/L，0.01 μmol/L。將ATP標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液加入白色96孔板中，每孔20 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入100 μL檢測(cè)工作液，迅速用酶標(biāo)儀通過(guò)化學(xué)發(fā)光通道檢測(cè)RLU值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各樣品組的ATP含量以及蛋白濃度，通過(guò)比例可以算出每mg蛋白中所含有ATP的量。

1.2.6 Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞中蛋白水平

細(xì)胞接種及給藥方式同1.2.4，每孔用200 μL含有1%蛋白酶抑制劑（PMSF）的細(xì)胞裂解液（RIPA）冰上充分裂解細(xì)胞后12000 g 4℃離心5 min，取上清10 μL檢測(cè)蛋白濃度，另取160 μL上清加入40 μL 5×上樣緩沖液（loading buffer），充分混勻后100℃加熱10 min，得到樣品液。根據(jù)各組樣品的蛋白濃度換算出各組上樣量（電泳蛋白上樣量為30 μg），公式為：v=1.25×30/c（對(duì)應(yīng)蛋白濃度）。

配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，根據(jù)計(jì)算出的上樣量將樣品加入各凝膠泳道中，用1×上樣緩沖液補(bǔ)齊每一泳道的樣品總體積。加滿電泳液，80 V恒壓電泳15 min，120 V恒壓電泳約60 min使目標(biāo)條帶分子量完全分開。取出膠塊，用甲醇活化過(guò)的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為恒流300 mA 45 min，冰浴。將PVDF膜置于5% BSA封閉液中室溫?fù)u床封閉1 h，用目標(biāo)蛋白的一抗稀釋液在4℃下?lián)u床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。用一抗相同種屬的二抗稀釋液室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。將配制好的ECL顯色工作液均勻鋪滿PVDF膜，用凝膠成像儀進(jìn)行曝光成像，并用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞處理步驟同1.2.4，胰酶消化，離心收集細(xì)胞后，以緩沖液：Annexin V：PI=100：1：1的比例配制工作液，重懸細(xì)胞，避光37℃孵育30 min后PBS洗滌3次，以PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀（貝德曼C6）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 HPLC檢測(cè)不同細(xì)胞組分中煙堿含量

利用細(xì)胞線粒體分離試劑盒（碧云天）對(duì)細(xì)胞（前處理同1.2.4）進(jìn)行線粒體提取和分離。對(duì)分離后的組分進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)組分純度。各組分的細(xì)胞裂解液取200 μL，加入1 mL乙酸乙酯，振蕩混勻10 min，離心后取800 μL上清，揮干，用8：2甲醇水200 μL復(fù)溶，離心取180 μL上清，得到待測(cè)樣品溶液。配制濃度分別為2、5、10、20、50、100 ng/mL的煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，選用對(duì)乙酰氨基酚為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。用相同條件和方法檢測(cè)樣品溶液，得到樣品中煙堿的含量。高效液相色譜分析參照文獻(xiàn)[28]中的實(shí)驗(yàn)條件，具體如下：

色譜柱型號(hào)：Thermo C18 100×2.1 mm；

流動(dòng)相：10 mmoL醋酸銨：甲醇=15：85。

1.2.9 PD果蠅給藥

選取150只一日齡的野生型雄性果蠅為對(duì)照組，選取150只一日齡的帕金森疾病模型（Parkin null）雄性果蠅為疾病組，選取150只一日齡的帕金森疾病模型雄性果蠅為治療組。對(duì)照組與疾病組均給予正常食物，治療組給予含有10 μmol/L煙堿的食物。每一組果蠅分為3管平行組，每小組50只。每天更換食物并記錄生存率。

果蠅行為學(xué)檢測(cè)：各組果蠅培養(yǎng)到50天時(shí)，進(jìn)行爬行實(shí)驗(yàn)。將每組果蠅隨機(jī)取出30只存活果蠅，轉(zhuǎn)移至帶有刻度的透明長(zhǎng)管中，兩頭用棉花塞緊，饑餓處理2 h后，將管子豎直放置，果蠅從底端開始往上爬行，記錄1 min內(nèi)能爬過(guò)20 cm高度的果蠅數(shù)量并記錄。每組果蠅重復(fù)爬行3次，每次爬行后間隔5 min。最后計(jì)算出各組果蠅的爬行率。

1.2.10 果蠅大腦中的多巴胺含量檢測(cè)

每組取10只果蠅用CO2麻醉，在顯微鏡下用手術(shù)級(jí)鑷子剝離出完整的果蠅大腦，置于120 μL PBS中，用超聲細(xì)胞粉碎儀破碎組織（冰浴，超聲2 s，暫停2 s，共15次），10000 g 4℃離心15 min，取100 μL上清即為待測(cè)樣品溶液。使用多巴胺檢測(cè)試劑盒（金霖生物）提供的檢測(cè)試劑和方法，配制一系列濃度梯度（1000 pg/mL，333.33 pg/mL，111.11 pg/mL，37.04 pg/mL，12.35 pg/mL）的多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，把標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品溶液加入試劑盒提供的96孔板中，每孔50μL，先后用試劑盒提供的檢測(cè)工作液A、B于37℃各孵育1 h后，吸去孔中溶液，每孔加入90 μL底物溶液，37℃避光顯色后加入50 μL終止液。隨即用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各組果蠅大腦中多巴胺含量。

1.2.11 果蠅大腦中的ATP含量檢測(cè)

每組取10只果蠅用CO2麻醉，在顯微鏡下用手術(shù)級(jí)鑷子剝離出完整的果蠅大腦，置于120 μL PBS中，用超聲細(xì)胞粉碎儀破碎組織（冰浴，超聲2 s，暫停2 s，共15次），10000 g 4℃離心15 min，取100 μL上清即為待測(cè)樣品溶液。使用同1.2.5所述相同試劑盒的相同檢測(cè)方法對(duì)每組果蠅大腦裂解液進(jìn)行檢測(cè)，分析方法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Prism 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異，利用t-test函數(shù)進(jìn)行分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 煙堿與MAO-B蛋白相互作用的Docking理論結(jié)果

Docking是通過(guò)研究配體與受體（生物大分子）之間的相互作用，預(yù)測(cè)兩者結(jié)合模式和親和力進(jìn)而從分子層面解釋配體起作用的機(jī)制[29]。通過(guò)對(duì)煙堿、Pargyline與MAO-B蛋白Docking分析，分別計(jì)算出煙堿和Pargyline的活性位點(diǎn)與MAO-B功能域FAD反應(yīng)位點(diǎn)的距離。如圖1所示，在兩者最穩(wěn)定構(gòu)象中，煙堿與FAD的反應(yīng)位點(diǎn)間距為3.8 ?，而Pargyline與FAD的反應(yīng)位點(diǎn)間距為5.1 ?。結(jié)果表明煙堿具有與MAO-B蛋白結(jié)合的理論基礎(chǔ)，且反應(yīng)位點(diǎn)間距短于MAO-B抑制劑Pargyline。

圖1 小分子與蛋白互作用Docking模擬結(jié)果Fig.1 Docking analysis of Nicotine / MAO-B (1), Pargyline /MAO-B (2)

2.2 煙堿對(duì)MAO-B純蛋白的抑制率

Docking結(jié)果為證明煙堿可以抑制MAO-B提供了理論基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)之上，利用人工重組的人源MAO-B蛋白（Sigma），通過(guò)Amplex Red試劑盒檢測(cè)分析，驗(yàn)證煙堿對(duì)MAO-B的抑制作用。如圖2(1)所示，煙堿在體外可抑制MAO-B蛋白的活性，且隨煙堿濃度增加抑制效果越來(lái)越強(qiáng)。由圖2(2)結(jié)果可知，當(dāng)煙堿在0～0.1 μmol/L濃度區(qū)間內(nèi)，蛋白抑制率高于Pargyline，當(dāng)濃度大于1 μmol/L時(shí)，抑制率略低于Pargyline，但可達(dá)80%及以上。以上結(jié)果證明在體外環(huán)境下，低濃度煙堿即可有效抑制MAO-B蛋白活性。

2.3 煙堿抑制細(xì)胞PD模型MAO-B的作用及對(duì)凋亡的影響

圖2 煙堿對(duì)MAO-B活性抑制作用Fig.2 The inhibitory effect of nicotine on MAO-B

圖3 煙堿在細(xì)胞PD模型中的保護(hù)作用Fig.3 The protective effect of nicotine in cellular PD model

SH-SY5Y是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有多巴胺能，它表達(dá)酪氨酸羥化酶，也可產(chǎn)生多巴胺，是研究PD常用的細(xì)胞系[18]。但SH-SY5Y自身MAO-B表達(dá)量很低，本研究利用基因編輯方法成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)MAO-B的神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y POE MAO-B。如圖3（3）所示，SH-SY5Y POE MAO-B細(xì)胞系中可以穩(wěn)定表達(dá)MAO-B蛋白。在此基礎(chǔ)上，利用誘導(dǎo)PD模型常用的神經(jīng)毒素MPTP，構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞的PD模型。用MTT篩選出100 μmol/L MPTP孵育24 h，作為后續(xù)細(xì)胞的PD模型條件。在此基礎(chǔ)上，研究煙堿的保護(hù)作用。如圖3（1）（2）所示，當(dāng)細(xì)胞只給予MPTP刺激時(shí)，過(guò)表達(dá)MAO-B的神經(jīng)細(xì)胞比正常的神經(jīng)細(xì)胞活力低5%左右，而當(dāng)加入不同濃度煙堿時(shí)，過(guò)表達(dá)MAO-B的細(xì)胞系活力逐漸恢復(fù)且優(yōu)于普通神經(jīng)細(xì)胞?；贛PTP的作用機(jī)制是通過(guò)破壞線粒體呼吸鏈而影響線粒體的功能，進(jìn)一步分析細(xì)胞給藥前后的NAD+以及ATP水平，觀察煙堿對(duì)神經(jīng)細(xì)胞代謝水平的影響。如圖3（4）所示，在過(guò)表達(dá)MAO-B的細(xì)胞中，當(dāng)給予1 μmol/L濃度煙堿時(shí)，細(xì)胞中NAD+含量顯著升高至5.5 nmol/L與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而給予10 μmol/L，100 μmol/L濃度煙堿時(shí)，該細(xì)胞中NAD+水平也略有上升。從圖3（5）ATP檢測(cè)結(jié)果可見，煙堿以及Pargyline對(duì)于過(guò)表達(dá)MAO-B的細(xì)胞系中ATP水平的升高促進(jìn)作用優(yōu)于普通神經(jīng)細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為闡明煙堿保護(hù)多巴胺能細(xì)胞系的分子機(jī)制，通過(guò)Western-Blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)MAO-B細(xì)胞中凋亡蛋白水平的變化，結(jié)果如圖3(6)所示，給予MPTP刺激的細(xì)胞中P-JNK，C-PARP蛋白表達(dá)均顯著升高，而同時(shí)加入MPTP和煙堿的細(xì)胞中對(duì)應(yīng)的蛋白水平均有所下降。最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖3（7）所示，在過(guò)表達(dá)MAO-B的神經(jīng)細(xì)胞中，煙堿和Pargyline都可在一定程度上抑制由MPTP引起的凋亡。MPTP刺激細(xì)胞后，凋亡早期細(xì)胞比例由對(duì)照組的77.4%增加到84.7%，而同時(shí)加入MPTP和煙堿的細(xì)胞中，晚凋細(xì)胞比例降低至77.5%，Pargyline組也有類似的趨勢(shì)。

2.4 煙堿進(jìn)入細(xì)胞后的分布

MAO-B表達(dá)于線粒體外膜，為明確煙堿是否可直接與MAO-B相互作用，通過(guò)HPLC對(duì)細(xì)胞不同組分中的煙堿含量進(jìn)行檢測(cè)。首先分離細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)組分，用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證組分純度如圖4（1）。在此基礎(chǔ)上對(duì)各組分進(jìn)行HPLC檢測(cè)，煙堿含量分布如圖4所示。當(dāng)煙堿濃度為1 μmol/L時(shí)如圖4（2），給藥后0.5 h，胞質(zhì)中濃度達(dá)到80 ng/μg，2 h后降至1.5 ng/mL，檢測(cè)結(jié)果與第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)0.5 h組別相比，具有顯著性差異。而線粒體中，從給藥后0.5 h至6 h，濃度均在25 ng/μg左右，無(wú)明顯改變。當(dāng)煙堿濃度為10 μmol/L時(shí)如圖4（3），給藥后0.5 h，胞質(zhì)中濃度達(dá)到85 ng/μg，2 h后降至30 ng/μg，檢測(cè)結(jié)果與第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)0.5 h組別相比，具有顯著性差異。6 h時(shí)，胞質(zhì)濃度又上升至65 ng/μg，而在線粒體組分中，濃度仍維持在25 ng/μg左右，略有下降但無(wú)明顯變化。這些結(jié)果提示，煙堿的確可以到達(dá)線粒體，這也為其抑制線粒體外膜上的MAO-B提供了空間基礎(chǔ)。

圖4 煙堿進(jìn)入細(xì)胞后在不同組分中的含量分布（Myto：線粒體；Cyto：胞質(zhì)）Fig.4 Content distribution of nicotine in different cell components (Myto: Mitochondria; Cyto: Cytoplasm)

2.5 煙堿對(duì)果蠅PD模型保護(hù)作用

果蠅生命周期較短，易于養(yǎng)育，它的基因和人有將近70%的一致性，因此經(jīng)常被用作疾病模型[19]。Parkin基因缺失可導(dǎo)致家族型PD，果蠅敲除Parkin基因也可以產(chǎn)生PD相關(guān)癥狀，包括多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞死亡、多巴胺水平下降、運(yùn)動(dòng)功能受損等[20]。本實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果也表明，MAO-B的活性在Parkin基因敲除果蠅高于正常對(duì)照[27]。為明確煙堿在動(dòng)物水平對(duì)PD的對(duì)抗作用，在果蠅食物中加入煙堿，研究煙堿對(duì)Parkin基因缺陷的PD果蠅的保護(hù)作用?；谇捌谠诩?xì)胞中篩選出煙堿給藥濃度為1 μmol/L，在果蠅實(shí)驗(yàn)中，將煙堿配成在食物中終濃度為細(xì)胞給藥濃度十倍的10 μmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖5（1）所示，Parkin null果蠅老齡時(shí)翅膀呈現(xiàn)無(wú)法收攏的狀態(tài)，而Wild type果蠅翅膀可以正常收攏，喂食煙堿的Parkin null果蠅翅膀形態(tài)有所改善。如圖5（2）（3）（4）所示，Wild type果蠅的爬行率，大腦多巴胺含量，肌肉組織ATP含量均顯著高于Parkin null果蠅，而喂食煙堿的Parkin null果蠅相應(yīng)指標(biāo)也有所改善。

圖5 煙堿對(duì)PD果蠅的保護(hù)作用Fig.5 Protective effect of nicotine on drosophila PD model

3 討論

MAO-B是帕金森發(fā)病過(guò)程中重要的致病因子[30-33]，MAO-B蛋白含有與半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子，并與兩個(gè)酪氨酸殘基一起形成一個(gè)活性空腔，通過(guò)兩個(gè)電子催化胺類底物的α-碳氧化。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，煙堿和幾種商業(yè)化的MAO-B抑制劑（Pargyline，Selegyline，Rasagyline等）結(jié)構(gòu)類似，都屬于香豆素衍生物或（雜）芳酰胺類[26]。因此通過(guò)小分子與蛋白Docking模擬分析，發(fā)現(xiàn)煙堿可以順利進(jìn)入MAO-B蛋白活性空腔；且其吡啶環(huán)上的N活性較高，可以與MAO-B蛋白FAD輔酶上的活性位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)；反應(yīng)之后的構(gòu)象能量較低，較為穩(wěn)定，這為煙堿可以抑制MAO-B蛋白活性提供了有力的理論基礎(chǔ)。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用商業(yè)試劑盒對(duì)煙堿在體外對(duì)MAO-B抑制效果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)煙堿小濃度時(shí)即可達(dá)到較明顯的抑制率，但當(dāng)濃度逐漸增大時(shí)，抑制效果趨于飽和，即使再增加濃度也無(wú)法完全抑制MAO-B的活性。推測(cè)可能是由于煙堿與MAO-B蛋白的結(jié)合方式為可逆的，最高抑制率接近90%。

在體外驗(yàn)證煙堿確實(shí)具有抑制MAO-B活性的作用后，進(jìn)行亞細(xì)胞器分離實(shí)驗(yàn)，明確了煙堿可以分布于線粒體，為其與線粒體外膜上的MAO-B提供了空間結(jié)合的理論基礎(chǔ)。接著構(gòu)建過(guò)表達(dá)MAO-B的神經(jīng)細(xì)胞系，利用MPTP可以被MAO-B催化氧化為神經(jīng)毒性物質(zhì)MPP+的特性[31-32]，構(gòu)建了細(xì)胞PD模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示煙堿對(duì)過(guò)表達(dá)MAO-B的細(xì)胞系的保護(hù)作用要優(yōu)于普通的神經(jīng)細(xì)胞系。這間接證明了煙堿極有可能通過(guò)抑制MAO-B活性，減少對(duì)MPTP的氧化，進(jìn)一步減少了MPP+和過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，減輕了神經(jīng)毒性作用和氧化應(yīng)激作用。這在WB結(jié)果中也得到了驗(yàn)證，MPTP組別中氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白P-JNK表達(dá)升高，而給予煙堿后，該蛋白表達(dá)量下降。本研究對(duì)細(xì)胞代謝標(biāo)志物NAD+和ATP含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果一致證實(shí)了煙堿對(duì)過(guò)表達(dá)MAO-B細(xì)胞系的保護(hù)作用。而流式凋亡檢測(cè)結(jié)果和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP的變化，也驗(yàn)證了在低濃度煙堿（1 μmol/L，10 μmol/L）給藥條件下，可以緩解MPTP所引起的過(guò)表達(dá)MAO-B神經(jīng)細(xì)胞凋亡。最后，通過(guò)HPLC檢測(cè)了煙堿進(jìn)入細(xì)胞后不同時(shí)間在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的分布情況，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中的煙堿含量隨給藥濃度的增大有所增加，但在線粒體中，加大給藥濃度或是給藥時(shí)間，煙堿的含量基本保持穩(wěn)定。這可能是由于煙堿給藥半小時(shí)之內(nèi)即可到達(dá)線粒體，并于線粒體外膜上的MAO-B結(jié)合，只有結(jié)合的煙堿分子留在線粒體內(nèi)，多余的煙堿則回到胞質(zhì)中，而線粒體上MAO-B蛋白含量有限，因此線粒體中煙堿很容易達(dá)到飽和，且結(jié)合后不易被細(xì)胞代謝排出胞外。目前主流的觀點(diǎn)認(rèn)為煙堿對(duì)抗帕金森癥的機(jī)制為結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞外膜上的乙酰膽堿受體，激活一系列GABA能信號(hào)通路。本研究驗(yàn)證了煙堿可進(jìn)入細(xì)胞并到達(dá)線粒體，而MAO-B是存在于線粒體外膜上的蛋白，這為認(rèn)識(shí)煙堿抑制MAO-B提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。該研究首次構(gòu)建可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)MAO-B的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞系，以PD模型進(jìn)行了研究，為認(rèn)識(shí)煙堿對(duì)抗帕金森病的機(jī)制提供了新的思路。

最后在果蠅PD模型中進(jìn)行了活體實(shí)驗(yàn)[34-35]，驗(yàn)證煙堿在體內(nèi)是否能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在煙堿低濃度（10 μmol/L）給藥條件下，可有效緩解疾病組的肌肉狀態(tài)（從肌肉組織ATP含量和翅膀形態(tài)可見），提高大腦多巴胺含量，原因可能是煙堿抑制MAO-B活性之后可以減少對(duì)多巴胺的降解，從而提高腦內(nèi)多巴胺含量[36]。因此從多巴胺含量的變化來(lái)看，煙堿具有通過(guò)抑制MAO-B活性來(lái)發(fā)揮對(duì)抗帕金森疾病的可能性。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究從理論模擬、體外蛋白水平證實(shí)了煙堿對(duì)MAO-B的抑制作用，在細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平驗(yàn)證了煙堿可能通過(guò)抑制MAO-B對(duì)抗帕金森癥表型的作用。這一保護(hù)機(jī)制不同于已報(bào)道研究結(jié)果，為充分認(rèn)識(shí)煙堿對(duì)抗帕金森病的機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為有效開發(fā)利用煙草提供了新思路。