周俊輝，孟憲慧△，高 潔

(1.河南省胸科醫(yī)院麻醉科，鄭州 450008；2.鄭州大學人民醫(yī)院麻醉科，鄭州 450003)

肺癌根治術中常用的單肺通氣(OLV)是一種非生理性呼吸模式，可為手術提供極大便利。但長時間(>2 h)的OLV可能會導致術后發(fā)生低氧血癥、肺損傷甚至急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，增加術后肺部并發(fā)癥(PPCs)發(fā)生率，影響患者臨床預后，尤其是老年患者更是如此。非通氣側肺萎陷和復張可引起缺氧復氧性肺損傷，再加上OLV期間機械通氣引起的氧化應激反應，可造成明顯的急性肺損傷[1]。肺泡巨噬細胞(AM)是ARDS及肺損傷的重要效應細胞，在肺部炎性反應及組織修復中有重要作用[2]。OLV后對非通氣側肺進行持續(xù)給氧可改善OLV結束后肺的氧合功能，減輕食管切除術OLV結束后的全身和非通氣側肺的炎性和氧化應激反應[3]；但其對非通氣側肺損傷時AM的凋亡及自噬有無影響尚少有相關研究證實。本研究擬探討OLV時非通氣側肺持續(xù)中低流量給氧對老年肺癌根治術患者非通氣側肺損傷時AM凋亡及自噬的影響，以期提供臨床參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1病例資料

本研究方案經河南省胸科醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批同意(倫理審批號：2019-02-011)，術前已征得患者及其委托人的同意，且簽署知情同意書。2019年4月至2020年5月于河南省胸科醫(yī)院手術室擇期行胸腔鏡下肺癌根治術的老年患者共60例，其中，男35例，女25例，年齡65～80歲，體重40～75 kg，身高150～185 cm。美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(ASA)分級Ⅱ～Ⅲ級。排除標準：嚴重的肺部疾病；肝腎功能不全；癡呆癥，帕金森病，腦卒中，吸毒或長期服用精神類藥物；嚴重的心臟傳導阻滯，高血壓、冠心病和糖尿?。婚L期服用類固醇類藥物、激素藥物；近期有重大手術史。剔除標準：圍術期發(fā)生不良事件如出血量大于600 mL；圍術期感染；麻醉時間大于5 h；再次手術。納入患者依據隨機數字表法被分成研究組和對照組，每組30例。

1.1.2試劑及藥物

丙泊酚(北京費森尤斯卡比華瑞制藥有限公司)；舒芬太尼、瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責任公司)，羅庫溴銨(浙江仙琚制藥股份有限公司)；右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；羥考酮[萌蒂(中國)制藥有限公司]；羅哌卡因(英國阿斯利康制藥有限公司)；舒更葡糖鈉(荷蘭Organon公司)；Alex Fluor標記的CD11b抗體、PE-Cy7標記的Siglec F抗體和APC標記的CD11c抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)一抗、Bcl-2相關X蛋白(Bax)一抗、微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3)-Ⅰ一抗、LC3-Ⅱ一抗和Beclin-1一抗(英國Abcam公司)；抗GAPDH一抗(美國CST公司)；辣根過氧化物酶標記的二抗(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1麻醉方法

患者術前禁飲禁食。入室后常規(guī)監(jiān)測心電圖、無創(chuàng)血壓及血氧飽和度。建立上肢外周靜脈通道，輸注乳酸鈉林格液6～8 mL/kg。局部麻醉下行橈動脈穿刺置管并監(jiān)測動脈壓。全麻誘導采用依托咪酯0.3 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和羅庫溴銨0.6 mg/kg，選用35#(女性)或37#(男性)的可視化雙腔支氣管進行氣管內插管，機械通氣。行右側頸內靜脈穿刺置管。麻醉維持采用全憑靜脈麻醉，靜脈泵注丙泊酚4.0～8.0 mg·g-1·d-1、瑞芬太尼0.05～0.20 μg·g-1·d-1、右美托咪定0.20～0.70 μg·g-1·d-1及羅庫溴銨0.3～0.6 mg·g-1·d-1。術中腦電雙頻指數(BIS)維持在40～60。雙肺通氣時潮氣量8 mL/kg，OLV時潮氣量6 mL/kg。吸入氧濃度為60%～80%，維持氧飽和度大于或等于92%。術中輸注平衡晶體液3 mL·g-1·d-1。術畢時4個成串刺激(TOF)值大于或等于0.9，則可拔除氣管插管；若TOF值小于0.9，則使用舒更葡糖鈉2 mg/kg進行拮抗后拔除氣管插管。術畢前15 min靜脈注射羥考酮0.1 mg/kg，縫皮前手術切口皮下浸潤注射0.25%羅哌卡因?；颊咝g后送入麻醉后恢復室。

1.2.2干預措施

OLV后研究組從非通氣側肺置入長度為65 cm的F14導管于氣管隆嵴分叉后2～3 cm，并給予1～4 L/min的持續(xù)性中低流量給氧；對照組非通氣側肺不給予持續(xù)性中低流量給氧，只置入F14導管于氣管隆嵴分叉后2～3 cm。

1.2.3血氣分析

于麻醉誘導后即刻(T0)和OLV后 30 min (T1)、1 h (T2)及2 h (T3)時采集橈動脈，采用GEM Premier 3000血氣分析儀(美國IL公司)進行血氣分析。

1.2.4采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)

T3時在可視化雙腔支氣管的大、小套囊均鼓起的情況下對非通氣側肺進行BALF采集。本操作由纖維支氣管鏡技術熟練者實施完成。選用BF-1T260型電子支氣管鏡(日本Olympus公司)，將其末端與兩組患側肺中葉或舌葉的葉支氣管開口處緊密契合，將溫度為37 ℃的醫(yī)用生理鹽水緩慢注入，每次灌洗液量為40 mL，共3次，總量為200 mL，灌注后用50～100 mm Hg負壓吸引緩慢回收，回收率≥40%為回收成功，BALF經雙層無菌紗布過濾，4 ℃冷卻10 min，再以3 000 r/min離心15 min，留取上清液，置于—20 ℃下以備后續(xù)檢測用。

1.2.5評價肺組織學

T3時切取已切除肺癌周邊正常的肺組織，置于4%中性甲醛溶液中進行固定。固定好的肺組織進行石蠟包埋，組織切片后用蘇木精和伊紅染色(HE)染色，并由對方案和研究組不知情的病理科醫(yī)師進行SZ51光鏡(日本Olympus公司)檢測并進行肺損傷評分的評估[4]。

1.2.6AM分選

利用Alex Fluor標記的CD11b抗體、PE-Cy7標記的Siglec F抗體和APC標記的CD11c抗體來標記人AM[CD11b(-)、CD11c(+)、Siglec F(+)]。從離心后的BALF中收集細胞并制成細胞懸液，加入抗體，避光冰浴30 min，向離心管中加入1 mL流式緩沖液終止染色，迅速離心去除上清液，將細胞重新用200 μL流式緩沖液懸起，通過細胞濾網后，使用MoFloAstrios EQ流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)進行流式細胞分選。

1.2.7流式細胞術檢測AM凋亡

按試劑盒說明書進行操作，將分選出的AM與FITC標記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)孵育，通過流式細胞術分析AM的凋亡比例。

1.2.8Western blot檢測AM內細胞凋亡和自噬標志蛋白

AM內總蛋白提取及蛋白濃度測定按照試劑盒操作說明書進行?？偟鞍纂娪巨D膜，脫脂牛奶封閉，Bcl-2一抗、Bax一抗、LC3-Ⅰ一抗、LC3-Ⅱ一抗和Beclin-1一抗(稀釋濃度均為1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶2 000)孵育4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，ECL試劑發(fā)光顯影，Image J圖像分析系統(tǒng)獲取各條帶的吸光度值。AM內Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達量，計算Bcl-2/Bax比值和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組患者一般臨床資料

兩組患者年齡、體重指數(BMI)、性別、ASA分級、術前第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)、雙肺通氣時間、PaO2、PaCO2、OLV時間、手術時間、麻醉時間、出血量和輸液量等差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料的比較(n=30)

2.2 兩組患者不同時間點血氣分析結果

與T0時比較，T1～3時兩組PaO2均顯著下降(P<0.05)，PaCO2均顯著升高(P<0.05)。T1～3時研究組PaO2較對照組均顯著升高(P<0.05)，PaCO2較對照組均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者不同時間點血氣分析結果的 比較

2.3 兩組患者肺組織病理學結果

對照組肺泡壁增厚、水腫，可見大量中性粒細胞和單核細胞，肺泡腔內可見較多炎性滲出，肺間質明顯增生可見大量炎性細胞浸潤。研究組肺泡間隔增寬，毛細血管未見明顯充血，小部分肺泡腔可見紅細胞及炎性滲出液，肺間質炎性細胞浸潤明顯減少，見圖1。

2.4 兩組患者肺損傷評分及AM凋亡率

T3時研究組肺損傷評分較對照組明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，研究組AM存活細胞率明顯升高(P<0.05)，AM早期凋亡率和晚期凋亡率明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 兩組患者肺損傷評分及AM凋亡率的比較

2.5 兩組BALF中AM內Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達量及Bcl-2/Bax比值和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

與對照組比較，研究組AM內Bcl-2、LC3-Ⅰ蛋白表達量明顯升高(P<0.05)，Bax、LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達量均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低(P<0.05)，見圖2、表4。

A：對照組；B:研究組。

圖2 兩組BALF中AM內Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達量

表4 兩組BALF中AM內Bcl-2、Bax、LC3和Beclin-1蛋白表達量及Bcl-2/Bax比值 和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的比較

3 討 論

OLV期間因機械通氣不足引起的肺不張、氧合功能下降、炎性反應和肺損傷等均可導致患者肺臟的病理生理學變化[5]。OLV時非通氣側肺雖沒有氧合作用，但仍有血液供應，肺血分流率(Qs/Qt)增加[6]。當氧吸入濃度和血流動力學等指標一致時，OLV時肺泡-動脈氧分壓差(A-aDO2)較雙肺通氣時更大，且PaO2較雙肺通氣時更低。本研究結果表明，兩組患者在OLV后均具有不同程度的氧合功能下降，而OLV期間給予非通氣側肺持續(xù)性中低流量給氧則可改善OLV后氧合功能，顯著減少OLV后低氧血癥的發(fā)生，對肺組織起到有效的保護作用。

本研究參照文獻[7]，通過可視支氣管鏡下以1～4 L/min的流速持續(xù)性中低流量給氧，可顯著地改善氧合功能，但不影響手術操作，該方法稱為非通氣側肺持續(xù)性給氧。非通氣側肺持續(xù)給氧可改善OLV期間的氧合功能并降低Qs/Qt[8]。本研究結果顯示，研究組肺損傷評分較對照組明顯降低，提示術中非通氣側肺持續(xù)中低流量給氧可減輕非通氣側肺損傷，這與其可改善患者氧合功能有關。OLV誘發(fā)肺損傷的機制非常復雜，包括機械通氣、低氧血癥和氧化應激反應[9]。本研究結果顯示，OLV期間給予非通氣側肺持續(xù)性中低流量給氧則可減少低氧血癥，故其對OLV誘發(fā)的肺損傷亦有一定的減輕作用。

細胞凋亡在再灌注肺損傷中扮演著重要角色[10]。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2家族成員，主要介導細胞凋亡，前者為抑凋亡蛋白，而后者為促凋亡蛋白[11]。因此，本研究通過Bcl-2/Bax比值來反映AM凋亡程度。本研究結果顯示，與對照組比較，研究組AM凋亡率明顯降低，而Bcl-2/Bax比值升高，提示，術中非通氣側肺持續(xù)中低流量給氧可減輕非通氣側肺損傷，而細胞凋亡的抑制在其中具有重要作用。另外，細胞自噬與再灌注肺損傷的關系也較為密切[12]。Beclin-1是調節(jié)自噬的關鍵蛋白質，是自噬啟動的標志性基因測定，Beclin-1表達可以預測自噬的發(fā)生情況[13]。LC3是第一個被發(fā)現的自噬體標記蛋白，調控微管蛋白的組裝和去組裝，參與自噬體形成[14]。Beclin-1和LC3目前最常用來檢測自噬水平。因此，本研究通過檢測LC3和 Beclin-1蛋白表達量來反映AM自噬程度。本研究結果顯示，與對照組比較，研究組AM內LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表達下調，提示術中非通氣側肺持續(xù)中低流量給氧可減輕非通氣側肺損傷，而細胞自噬的抑制在其中具有重要作用。然而，由于自噬與細胞凋亡的關系復雜，二者可由細胞外因素如缺氧、氧化應激和局部缺血再灌注傷害等觸發(fā)刺激。因此，AM凋亡與自噬之間的失衡可能有助于非通氣側肺損傷發(fā)生，而這需要進一步研究以探討術中非通氣側肺持續(xù)中低流量給氧與細胞凋亡及自噬之間的關系。