張 歡，張國(guó)君

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一血液內(nèi)科，沈陽(yáng) 110022)

成人急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是一類(lèi)以原幼淋巴細(xì)胞惡性增殖、分化障礙、凋亡受阻為特點(diǎn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1-2]。miR-520a在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)并發(fā)揮抑癌基因功能[4-7]，但其在急性淋巴細(xì)胞白血病的表達(dá)及意義國(guó)內(nèi)外尚少見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)MCM3基因在白血病、淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤中過(guò)度表達(dá)，且與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)[8-11]。MCM3是miR-520a的可能靶基因，目前尚少見(jiàn)miR-520a調(diào)控MCM3的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)組織、細(xì)胞中miR-520a 調(diào)控MCM3的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的影響，以期為B-ALL的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

人急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(BALL-1)購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；健康人外周血B淋巴細(xì)胞來(lái)自健康志愿者外周血。細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2骨髓標(biāo)本

選取2018年1月至2019年12月本院初診B-ALL患者30例,所有患者均為原發(fā)、無(wú)轉(zhuǎn)移、未經(jīng)過(guò)任何化療的初次病患。該研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018PS231)，并經(jīng)患者知情同意后進(jìn)行。20例非惡性血液病患者骨髓組織作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后采用lipofectamine 3000作為轉(zhuǎn)染試劑，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)基。miR-520a mimics、miR-520a inhibitor和miR-520a NC均購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司?？蛰d體pCDNA3.1和pCDNA3.1-MCM3野生型質(zhì)粒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物技術(shù)有限公司。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

使用TRIzol法分別提取各組細(xì)胞RNA，使用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒取0.2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用miRNA qRT-PCR TB Green?試劑盒和相應(yīng)引物通過(guò)qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法分析。以U6為內(nèi)參，計(jì)算miR-520a相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3Western blot

收集各組細(xì)胞后，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，加MCM3(Abcam兔抗人,1∶1 000)和β-actin(Abcam兔抗人,1∶2 000)一抗4 ℃過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶5 000)37 ℃孵育1 h；洗膜后ECL顯影，使用Image J軟件以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行條帶灰度分析。

1.2.4CCK-8測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔板(2×104個(gè)/mL)，每組設(shè)5個(gè)平行孔。12 h后，進(jìn)行細(xì)胞處理實(shí)驗(yàn)并觀察細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,以1 000 r/min離心10 min，棄上清液每孔加入10 μL CCK-8試劑和100 μL的PBS溶液，于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

1.2.5miR-520a靶基因預(yù)測(cè)

使用TargetScan(http://www.targetscan.org/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)MCM3是miR-520a可能的目標(biāo)靶基因，并找到他們之間的作用位點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.6雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)

化學(xué)合成包含有與miR520a互補(bǔ)結(jié)合的靶基因MCM3 3′-UTR序列片段和突變的MCM3 3′-UTR，細(xì)胞接種24孔板(2×104個(gè)/mL),待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-520a mimics+空載體組、miR-520a mimics+3′-UTR野生型組、miR-520a mimics+3′-UTR突變型組，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-520a在B-ALL患者骨髓淋巴細(xì)胞和BALL-1中的表達(dá)

結(jié)果顯示，miR-520a在非惡性血液腫瘤患者骨髓淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平顯著高于其在B-ALL患者骨髓淋巴細(xì)胞中的表達(dá)(圖1A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-520a在健康人外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于其在BALL-1細(xì)胞系中的表達(dá)(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 miR-520a能夠參與調(diào)控B-ALL細(xì)胞的增殖

向BALL-1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-520a mimics，檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后各組的BALL-1細(xì)胞增殖能力。與miR-NC組比較，miR-520a mimics組BALL-1細(xì)胞的增殖活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 miR-520a靶向MCM3基因mRNA 3′-UTR

Targetscan網(wǎng)站生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，MCM3基因mRNA 3′-UTR中含有與miR-520a互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖3A；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，與miR520 mimics+空載體組比較，miR-520 mimics+3′UTR野生型組的熒光活性顯著降低(P<0.05),miR-520 mimics+3'UTR突變型組的熒光活性無(wú)顯著變化(圖3B、C)。

為了進(jìn)一步證實(shí)MCM3是miR-520a的靶基因，使用miR-520a mimics BALL-1細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示在miR-520a mimics組的MCM3蛋白表達(dá)顯著低于在miR-NC組的表達(dá)(圖3D)。

A：miR-520a在非惡性血液腫瘤患者骨髓淋巴細(xì)胞(Normal lymphocyte)和B-ALL患者骨髓淋巴細(xì)胞中的表達(dá)比較；B：miR-520a在健康人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)和BALL-1中的表達(dá)比較;a：P<0.05。

2.4 MCM3過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-520a mimics調(diào)控BALL-1細(xì)胞增殖的作用

與miR-NC組相比，miR-520a mimics組BALL-1中MCM3的蛋白表達(dá)顯著降低(圖4A)，且miR-520a mimics組BALL-1細(xì)胞增殖活力顯著降低(圖4B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-520a mimics+pCDNA3.1組對(duì)比，miR-520a mimics+MCM3-WT組BALL-1細(xì)胞中MCM3蛋白表達(dá)水平顯著升高(圖4A)，miR-520a mimics+MCM3-WT組BALL-1增殖活力顯著增加(圖4B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：miR-520a mimics轉(zhuǎn)染BALL-1后miR-520a的表達(dá)水平變化；B：miR-520a mimics轉(zhuǎn)染BALL-1后細(xì)胞增殖率與miR-NC組比較；a：P<0.05。

A：通過(guò)Targetscan軟件分析miR-520a靶向MCM3基因mRNA 3′-UTR及作用位點(diǎn)；B、C：雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-520a與MCM3的3′-UTR結(jié)合情況；D：miR-520a mimics轉(zhuǎn)染后MCM3的蛋白變化；a：P<0.05。

A：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中MCM3蛋白表達(dá)水平；B：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力變化；1：miR-NC組；2：miR-520a mimics組；3：miR-520a mimics+pCDNA3.1組；4：miR-520a mimics+MCM3-WT組；a：P<0.05。

3 討 論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展常與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的改變密切相關(guān)。大量研究顯示，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤形成及發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。目前研究顯示，人體中有許多miRNA在腫瘤中起著類(lèi)似原癌基因或者抑癌基因的作用[12]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miR-520a在乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、骨肉瘤、肝癌等實(shí)體腫瘤均表現(xiàn)出抑癌因子的特征[13-17]。且miR-520a在慢性粒細(xì)胞白血病中能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。

本研究以成人B-ALL患者為研究對(duì)象，分析miR-520a在B-ALL群體中的表達(dá)特點(diǎn)，結(jié)果顯示成人B-ALL患者骨髓淋巴細(xì)胞和BALL-1細(xì)胞系中miR-520a表現(xiàn)明顯低表達(dá)水平，提示miR-520a的表達(dá)異常與BALL的發(fā)生、發(fā)展存在一定相關(guān)性。這與miR-520a在卵巢癌和乳腺癌中的低表達(dá)相一致，miR-520a在這兩種癌癥中也表現(xiàn)出低于正常組織的表達(dá)水平[19-20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在BALL-1中上調(diào)miR-520a的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，表示miR-520a可能在B-ALL中發(fā)揮抑癌基因的作用。這與miR-520a在許多癌癥中發(fā)揮的作用是一致的[13-17]。

TargetScan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，miR-520a與MCM3的3′UTR區(qū)域存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，僅miR-520 mimics+3′UTR野生型組熒光素酶活性顯著降低，提示miR-520a可能通過(guò)直接與MCM3的3′UTR區(qū)域結(jié)合抑制MCM3的表達(dá)，且在BALL-1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-520a，能夠顯著下調(diào)MCM3的蛋白表達(dá)水平。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-520a對(duì)MCM3的靶向調(diào)控作用，在miR-520a過(guò)表達(dá)組中過(guò)表達(dá)MCM3蛋白，發(fā)現(xiàn)MCM3過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-520a mimics調(diào)控BALL-1細(xì)胞增殖的作用。這表明miR-520a是通過(guò)抑制靶基因MCM3的表達(dá)參與調(diào)控BALL-1細(xì)胞的增殖過(guò)程。在肝癌中MCM3高表達(dá)并與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，可以作為一個(gè)肝癌進(jìn)展的標(biāo)志物[21]。MCM3的高表達(dá)提示結(jié)直腸癌預(yù)后不良，并促進(jìn)G1/S細(xì)胞周期的進(jìn)展、增殖、遷移和侵襲[22]?；虮磉_(dá)譜分析顯示MCM3能反映浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的預(yù)后[10]。高表達(dá)水平的磷酸化MCM3能夠促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡[23]。這些都揭示了MCM3在惡性腫瘤中的促癌作用，與MCM3在B-ALL中的促癌作用相一致。

綜上所述，本研究初步探討了miR-520a在B-ALL中的作用及機(jī)制，驗(yàn)證了miR-520a靶向調(diào)控MCM3的表達(dá)對(duì)BALL-1細(xì)胞增殖的影響，為B-ALL的分子靶向治療提供理論依據(jù)。然而，由于miRNA-靶基因調(diào)控的多樣性，關(guān)于miR-520a抑制B-ALL的生物學(xué)特征是否通過(guò)其他作用方式和信號(hào)通路，還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。