楊勝男，李卓群，徐海榮，王云帥，王皇建，寇 玉△

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225000；2.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院胃腸外科，河南洛陽 471000)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，2018年全球胃癌新發(fā)病例中胃癌位于惡性腫瘤發(fā)病率第5位、病死率第3位[1]。EphA2受體最初被稱為Eck(上皮細(xì)胞激酶)，由LINDBERG等1990年篩選人類上皮(HeLa)cDNA文庫得出，高表達(dá)于上皮來源的細(xì)胞系，在腸、肺、皮膚、腎臟中的表達(dá)較高[2]。EphA2受體與配體結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能直接參與各種生理活動(dòng),包括胚胎發(fā)育,特別是神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng),以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接、細(xì)胞的遷移等[3]。EphA2基因的過度表達(dá)常與不良預(yù)后相關(guān)。其參與了許多對(duì)惡性進(jìn)展至關(guān)重要的過程，如遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖、存活和血管生成[4-5]。在宮頸癌中，EphA2的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤肌層深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),且與宮頸癌患者分期預(yù)后相關(guān)，隨著宮頸病變病理分級(jí)升高，EphA2蛋白在相應(yīng)組織中表達(dá)陽性率逐漸提高[6]。但是關(guān)系EphA2與胃癌之間的關(guān)系報(bào)道較少，本文通過檢測(cè)EphA2在胃癌組織中的表達(dá)，分析EphA2表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系及預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 資料來源

收集2014年1月至2016年7月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院胃腸外科收治的胃癌手術(shù)治療且術(shù)后病理確診胃癌患者73例胃癌組織樣本，隨訪至2020年6月。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未經(jīng)放化療治療；(2)行胃癌根治性切除術(shù)，并經(jīng)病理醫(yī)師確診；(3)有詳細(xì)完整的病例及隨訪資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床病理資料不全者；(2)合并其他腫瘤疾病者；(3)術(shù)前經(jīng)過放化療者。

1.2 主要試劑

兔IgG免疫組織化學(xué)試劑盒SABC即用型1(SA1022)購自武漢博士德生物公司； DAB染色試劑盒(AR1022)購自武漢博士德生物公司；EphA2抗體(#6997)購自美國Cell Signaling Technology公司；蘇木精染色試劑(E808F A0004) 購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)

石蠟切片于60 ℃烤片2 h，二甲苯和乙醇按梯度脫蠟復(fù)水，3%過氧化氫避光室溫10 min滅活內(nèi)源酶，PBS漂洗3次，0.1%TritonX-100室溫透膜15 min，PBS漂洗3次，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液微波煮沸熱修復(fù)3 min,2次，PBS漂洗3次，5%BSA室溫封閉30 min，除去多余液體，滴加一抗(1∶1 000)，放置濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗3次，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)，室溫孵育1 h，PBS漂洗3次，DAB顯色約2 min，出現(xiàn)棕黃色蒸餾水終止顯色，用含乙醇的蘇木精染色約2 min，顯微鏡下觀察染色情況，脫水透明，中性樹脂封片。為了量化EphA2的免疫染色，將載玻片在相等的曝光量下進(jìn)行數(shù)字成像，并通過數(shù)字化的Image J軟件評(píng)估免疫陽性細(xì)胞百分比。細(xì)胞染色強(qiáng)度分為：0為不顯色；1為淺黃色；2為棕黃色；3為深褐色。免疫染色結(jié)果由免疫陽性細(xì)胞百分比(0～100)乘以染色強(qiáng)度得分(0、1、2和3)得出0～300分。以患者生存狀態(tài)作為狀態(tài)變量繪制ROC曲線圖,根據(jù)曲線圖形,EphA2表達(dá)評(píng)分在27.49分時(shí)對(duì)應(yīng)的約登指數(shù)最大,選取27.49分為最佳截點(diǎn)(圖1)，根據(jù)EphA2表達(dá)水平分為陰性組(<27.49分,n=33)和陽性組(≥27.49分,n=40)。

圖1 ROC曲線選取最佳截點(diǎn)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC曲線確定EphA2陽性陰性表達(dá)的截點(diǎn)。生存分析采用Kaplan-Meier分析和 Log-rank 檢驗(yàn)，單因素分析采用Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox回歸模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EphA2在胃癌組織中的表達(dá)

73例胃癌組織中，胃癌組織EphA2陽性率為54.8%，而癌旁組織中無陽性表達(dá)(P<0.05)，見表1。EphA2高表達(dá)于胃癌組織，染色較深；于癌旁組織低表達(dá)，染色較淺，見圖2。

表1 EphA2在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

圖2 EphA2在胃癌組織與癌旁組織的表達(dá)(SABC，×400)

2.2 EphA2表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性

EphA2的表達(dá)與腫瘤最大徑相關(guān)(P=0.009)，與患者性別、年齡及浸潤深度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性不顯著(P>0.05)，見表2。

2.3 EphA2表達(dá)與胃癌術(shù)后患者3年、5年生存率的關(guān)系

生存分析顯示，EphA2蛋白表達(dá)陽性與陰性患者之間的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。EphA2陽性組3年生存率為50.00%，5年生存率為0。EphA2陰性組3年生存率為69.69%，5年生存率為30.30%。EphA2陽性組3年生存率及5年生存率低于陰性組(P<0.05)。

圖3 EphA2陰性組與陽性組生存曲線

表2 EphA2與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表2 EphA2與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 影響患者無病生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素分析

單因素分析示，腫瘤最大徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及EphA2表達(dá)與胃癌患者無病生存時(shí)間相關(guān)(P<0.05)，見表3。多因素分析示，腫瘤最大徑、TNM分期及EphA2表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后無病生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表3 Kaplan-Meier單因素分析患者無病生存時(shí)間 及總生存時(shí)間影響因素

表4 COX回歸多因素分析患者無病生存時(shí)間影響因素

2.5 影響患者總生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素分析

單因素分析示，腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及EphA2表達(dá)與胃癌患者總生存時(shí)間相關(guān)(P<0.05)，見表3。多因素分析示：腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期及EphA2表達(dá)是影響胃癌患者術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表5。

表5 COX回歸多因素分析患者總生存時(shí)間影響因素

3 討 論

有研究報(bào)道，EphA2在腫瘤中不僅扮演著促癌因子的角色，還有作為抑癌因子的發(fā)現(xiàn)[7]。配體EphrinA1依賴的EphA2的激活主要發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖和遷移的作用。然而EphrinA1蛋白水平與腫瘤分期密切相關(guān)，晚期腫瘤患者中 EphrinA1蛋白表達(dá)較低[8-9]。過表達(dá)的EphA2在多種腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，如黑色素瘤、乳腺癌[10]、結(jié)腸[11]、肺癌[12]等。EphA2是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子和不良預(yù)后的關(guān)鍵預(yù)測(cè)因子[13-14]。本研究中，過表達(dá)的EphA2與胃癌的進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)。在腎細(xì)胞癌中，EphA2腎癌組織中過表達(dá)且與腫瘤大小、核分級(jí)、腫瘤分期、患者預(yù)后有顯著相關(guān)性[15]。本研究中，EphA2在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，EphA2表達(dá)與腫瘤最大徑相關(guān)，且腫瘤最大徑大于或等于4 cm，EphA2蛋白陽性表達(dá)率越高。

前列腺癌中，高表達(dá)EphA2組生化復(fù)發(fā)率高于低表達(dá)EphA2組，多因素分析顯示，高表達(dá)EphA2是生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素[16]。在喉鱗狀細(xì)胞癌中，癌組織中EphA2陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織。EphA2表達(dá)與喉癌組織學(xué)分級(jí)、T分期、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)，EphA2表達(dá)是影響喉癌預(yù)后的獨(dú)立因素，在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不良中可能起重要作用[17]。EphA2表達(dá)陽性與陰性患者之間的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述討論一致。Cox多因素分析結(jié)果顯示，EphA2高表達(dá)是影響胃癌患者預(yù)后無病生存時(shí)間及總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素綜合的復(fù)雜過程，其預(yù)后與多重因素相關(guān)[18]。研究報(bào)道，腫瘤最大徑[19]、TNM分期[20]、腫瘤分化程度[21]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[22]都是影響胃癌預(yù)后的重要因素。 本研究中,Cox回歸模型多因素分析還發(fā)現(xiàn)腫瘤最大徑、TNM分期、EphA2表達(dá)是患者影響患者無病生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腫瘤最大徑、分化程度、TNM分期及EphA2高表達(dá)是影響患者總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腫瘤最大徑越大、分化程度越差、TNM分期越差，患者預(yù)后越差。

綜上所述，EphA2在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，且與患者病理特征及預(yù)后相關(guān)，可作為臨床醫(yī)生評(píng)估患者預(yù)后的參考指標(biāo)之一。但本研究樣本量較少，下一步需擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究EphA2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義。