李昕曈,孫光濤，王 夢(mèng)，戚詢中，黃作義，黃昕艷，朱曉峰

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江佳木斯 154002；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江佳木斯 154002；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江157000)

持續(xù)乙醇攝入會(huì)導(dǎo)致腦容量降低，皮層神經(jīng)元丟失，其中以前額葉最明顯[1]；同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致多種神經(jīng)病理病變，如認(rèn)知功能損傷、癡呆等[2]。在這一過程中，炎性反應(yīng)發(fā)揮重要作用；在分子水平，持續(xù)乙醇攝入能夠增加腦皮質(zhì)神經(jīng)元促炎因子高遷移率族蛋白B1(HMGB1)表達(dá)，并通過HMGB1/TLR4(Toll-like receptor 4)途徑，促進(jìn)炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6的表達(dá)[2-3]； 但目前持續(xù)乙醇攝入活化HMGB1通路及其下游炎性反應(yīng)的分子機(jī)制尚不清楚。

在持續(xù)乙醇攝入誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，抗氧化通路發(fā)揮重要作用，同時(shí)，調(diào)節(jié)抗氧化通路活性，能夠緩解乙醇攝入所至的腦損傷[2]。課題組前期研究證實(shí)，核因子E2 相關(guān)因子2 (NRF2)廣泛參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)及腦保護(hù)過程[4]；研究已證實(shí)，NRF2通路參與HMGB1通路及炎性因子的表達(dá)調(diào)控過程[5-7]；但目前，尚缺乏NRF2在乙醇攝入相關(guān)疾病中的研究。

在腦功能調(diào)節(jié)過程中，前額葉通過其豐富的皮層間及皮層下聯(lián)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8]，參與思維、情緒、行為等多種高級(jí)腦機(jī)能的調(diào)控過程。同時(shí)，前額葉與抑郁障礙、精神分裂等多種神經(jīng)精神疾病密切相關(guān)。酗酒人群前額葉腦容量降低最為嚴(yán)重，是乙醇敏感至傷腦區(qū)之一[1]。因此，本課題在既往研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建持續(xù)乙醇攝入小鼠模型，觀察持續(xù)乙醇攝入對(duì)模型小鼠前額葉炎性反應(yīng)、HMGB1通路及NRF2通路的影響；并進(jìn)一步干預(yù)模型小鼠NRF2的表達(dá)，分析NRF2通路在持續(xù)乙醇攝入小鼠前額葉HMGB1通路及炎性反應(yīng)活化中的作用；為持續(xù)乙醇攝入導(dǎo)致腦損傷機(jī)制的闡述提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為NRF2通路相關(guān)藥物在乙醇攝入相關(guān)疾病中的應(yīng)用提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix與擴(kuò)增試劑盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自日本TaKaRa公司；神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)所用Neurobasal、B27、雙抗(P/S)、L-Glutamine均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。NRF2通路特異激動(dòng)劑特丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；HMGB1、NRF2、HO-1、β-actin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；蛋白裂解液RIPA、苯平基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑均購(gòu)自碧云天公司，其余試劑購(gòu)自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1持續(xù)乙醇攝入動(dòng)物模型制備

所用8周昆明雄性小鼠均來源于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有操作均符合NIH:80-23標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)佳木斯大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。乙醇干預(yù)模型采用腹腔注射法建模：乙醇用無菌PBS稀釋(20% v/v)，以2.0 g/kg對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，每天1次，持續(xù)7 d；對(duì)照組以無菌PBS代替進(jìn)行注射。

1.2.2模型干預(yù)及分組

為了明確NRF2通路在乙醇攝入活化HMGB1通路及炎性反應(yīng)中的作用，本實(shí)驗(yàn)在證實(shí)持續(xù)乙醇攝入能夠抑制模型小鼠前額葉NRF2通路基因表達(dá)的前提下，選用tBHQ干預(yù)模型小鼠，并檢測(cè)其對(duì)模型小鼠前額葉HMGB1通路及炎性反應(yīng)的影響；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組，乙醇干預(yù)組，tBHQ組(乙醇+tBHQ組)；tBHQ組在乙醇腹腔注射后，立即給予腹腔注射NRF2激動(dòng)劑tBHQ，劑量為16.7 mg/kg[9]。并選擇與乙醇攝入密切相關(guān)的炎性因子TNF-α、IL-1β及其上游HMGB1通路相關(guān)基因HMGB1、TLR2、TLR3、TLR4進(jìn)行檢測(cè)，觀察小鼠前額葉炎性基因mRNA表達(dá)變化。

1.2.3原代神經(jīng)元培養(yǎng)、鑒定及干預(yù)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證持續(xù)乙醇攝入通過抑制NRF2通路，進(jìn)而激活HMGB1通路并促進(jìn)其下游炎性反應(yīng)這一結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選用無血清培養(yǎng)法，應(yīng)用新生1～4 d內(nèi)昆明乳鼠皮層進(jìn)行原代神經(jīng)元培養(yǎng)，培養(yǎng)至第7天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)[10]；神經(jīng)元完全培養(yǎng)液：Neurobasal、B27、雙抗(P/S)、 L-Glutamine[11]。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組(PBS組)，乙醇干預(yù)組，tBHQ組(乙醇+tBHQ組)；于培養(yǎng)第7天，除對(duì)照組外，各組均加入乙醇進(jìn)行干預(yù)(75 mmol/L)[12]；tBHQ組加入tBHQ(40 ng/mL)；干預(yù)24 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

選用TRIzol 法提取前額葉及神經(jīng)元總RNA，選用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄樣本mRNA；選用嵌合熒光法擴(kuò)增試劑盒,以兩步法擴(kuò)增cDNA;檢測(cè)結(jié)果用2-ΔΔCt法分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。樣本mRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃降溫后取出保存。樣本 cDNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；擴(kuò)增，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；融解，95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，1個(gè)循環(huán)；降溫，50 ℃ 30 s。引物序列見表1。

1.2.5Western blot檢測(cè)

應(yīng)用裂解液(RIPA+PMSF+蛋白酶抑制劑)及研磨介質(zhì)破碎組織，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min后吸取上清液；應(yīng)用BCA 法檢測(cè)樣本蛋白濃度；而后經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(HMGB1 1∶8 000、HO-1 1∶1 500、NRF2 1∶500、β-a ctin 1∶5000)、洗膜、二抗孵育、洗膜、顯影，并獲取灰度值進(jìn)行各蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 持續(xù)乙醇攝入對(duì)模型小鼠前額葉炎性反應(yīng)及HMGB1通路的影響

與對(duì)照組相比，乙醇干預(yù)組小鼠前額葉炎性因子TNF-α(P=0.015)、IL-1β(P=0.017)mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高(圖1)；其上游HMGB1通路相關(guān)基因HMGB1(P=0.004)、TLR3(P=0.030)、TLR4(P=0.004)mRNA表達(dá)升高，但TLR2(P=0.071)表達(dá)無明顯變化，見圖1。

a：P<0.05，b:P<0.01。

2.2 持續(xù)乙醇攝入對(duì)模型小鼠前額葉NRF2通路的影響

為了分析持續(xù)乙醇攝入促進(jìn)炎性反應(yīng)的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了與炎性反應(yīng)相關(guān)的NRF2通路基因在模型小鼠前額葉表達(dá)的變化，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，乙醇干預(yù)組小鼠前額葉NRF2(P=0.014、0.014)及其下游血紅素氧合酶(HO-1)mRNA及蛋白相對(duì)表水平達(dá)均降低(P=0.030、0.012)，見圖2。

2.3 激活NRF2通路對(duì)持續(xù)乙醇攝入模型小鼠前額葉炎性反應(yīng)及HMGB1通路的影響

在對(duì)炎性反應(yīng)基因表達(dá)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)：與乙醇干預(yù)組小鼠比較，tBHQ組小鼠前額葉TNF-α mRNA(P=0.305)的表達(dá)并無影響；但tBHQ組IL-1β mRNA較乙醇干預(yù)組(P=0.003)的相對(duì)表達(dá)水平降低，同時(shí)，tBHQ組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.540)。在對(duì)HMGB1通路的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，與乙醇干預(yù)組小鼠比較，tBHQ組小鼠前額葉TLR3 mRNA的表達(dá)并無影響(P=0.679)，但tBHQ組HMGB1(P=0.000)、TLR4(P=0.015)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平及HMGB1(P=0.043)蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低；同時(shí)，tBHQ組以上HMGB1通路相關(guān)基因和蛋白與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.642)，見圖3。

A：NRF2與HO-1 mRNA表達(dá)變化；B：NRF2蛋白表達(dá)；C：HO-1蛋白表達(dá)；a:P<0.05。

A：炎性反應(yīng)及HMGB1通路基因mRNA檢測(cè)；B：HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè)。a:P<0.05;b:P<0.01;c:P<0.001。

2.4 激活NRF2通路對(duì)乙醇干預(yù)后神經(jīng)元HMGB1表達(dá)的影響

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，構(gòu)建了乙醇干預(yù)神經(jīng)元細(xì)胞模型，應(yīng)用MAP2標(biāo)記神經(jīng)元軸突，對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定(圖4C、D、E)；并檢測(cè)NRF2通路激動(dòng)劑對(duì)乙醇干預(yù)神經(jīng)元HMGB1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響；結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，乙醇干預(yù)后神經(jīng)元HMGB1 mRNA(P=0.000，圖4A)及蛋白相對(duì)表達(dá)水平(P=0.006，圖4B)明顯升高；與乙醇干預(yù)組相比，tBHQ組神經(jīng)元HMGB1 mRNA(P=0.001，圖4A)及蛋白相對(duì)表達(dá)水平(P=0.004，圖4B)明顯下降，tBHQ組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4A、B)。

A：HMGB1 mRNA檢測(cè)；B：HMGB1蛋白表達(dá)檢測(cè)；C：MAP2 神經(jīng)突染色(×400)；D：DAPI 和MAP2 染色合并(熒光，×400)；E：DAPI和MAP2染色合并(常光、DAPI和MAP2染色合并，×400)。a:P<0.01;b:P<0.001。

3 討 論

炎性反應(yīng)在乙醇攝入相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。既往研究顯示，持續(xù)乙醇攝入能夠促進(jìn)模型小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化，增加炎性因子TNF-α、IL-1β,IL-6和MCP-1的表達(dá)[13]；在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，持續(xù)乙醇攝入能夠增加模型小鼠前額葉炎性因子TNF-α、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)水平，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)，持續(xù)乙醇攝入能夠促進(jìn)腦組織炎性反應(yīng)發(fā)生。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，酒精性腦損傷炎性因子的表達(dá)受HMGB1通路調(diào)控。HMGB1是一種主要由神經(jīng)元分泌的內(nèi)源性細(xì)胞因子；通過與炎性細(xì)胞TLRs受體結(jié)合，參與炎性基因表達(dá)的調(diào)控[14-15]；研究顯示，HMGB1及其受體TLR2、TLR3和TLR4在酗酒人群及持續(xù)乙醇攝入大鼠模型內(nèi)嗅皮層表達(dá)升高[16]；同時(shí)，乙醇誘導(dǎo)HMGB1表達(dá)升高能夠促進(jìn)炎性因子如IL-1β表達(dá)[3,16]；在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，持續(xù)乙醇攝入能夠增加模型小鼠前額葉HMGB1及其受體TLR3和TLR4的表達(dá)，這一結(jié)果進(jìn)一步說明，持續(xù)乙醇攝入能夠促進(jìn)HMGB1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)活性。

既往研究顯示，持續(xù)乙醇攝入能夠增加腦內(nèi)氮氧化物 (NOX)表達(dá)，促進(jìn)活性氧(ROS)的生成，進(jìn)而促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]；這一結(jié)果說明，氧化及抗氧化通路在酒精性腦損傷過程中發(fā)揮重要作用。NRF2通路是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答通路之一，通過與抗氧化元件ARE結(jié)合調(diào)節(jié)抗氧化酶分泌，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[17]。進(jìn)一步研究指出，促進(jìn)NRF2表達(dá)能夠抑制小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子如IL-6，IL-1β及TNF-α的表達(dá)[5]；在腦出血模型中，激活NRF2通路能夠抑制IL-1β的表達(dá)[6]；這一結(jié)果說明，NRF2通路參與炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)過程。同時(shí)，在炎性疾病中，激活NRF2/HO-1通路能夠抑制HMGB1的表達(dá)[7]；這一結(jié)果說明，NRF2通路能夠通過抑制HMGB1通路調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)。但目前，尚缺乏NRF2在乙醇攝入相關(guān)疾病中的研究。

在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)乙醇攝入小鼠前額葉NRF2和HO-1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，提示持續(xù)乙醇攝入能夠抑制小鼠前額葉NRF2通路活性，同時(shí)，這一結(jié)果與HMGB1通路及炎性因子在模型前額葉表達(dá)升高相吻合。這一結(jié)果說明，NRF2通路可能參與了持續(xù)乙醇攝入活化HMGB1通路及炎性反應(yīng)的過程。為了進(jìn)一步說明NRF2通路在這一過程中的作用，課題選用NRF2通路激動(dòng)劑干預(yù)乙醇攝入動(dòng)物及細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，NRF2通路激動(dòng)劑能夠完全逆轉(zhuǎn)持續(xù)乙醇攝入引起的前額葉HMGB1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高以及神經(jīng)元HMGB1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，體內(nèi)體外結(jié)果相一致。這一結(jié)果說明，NRF2通路激動(dòng)劑能夠抑制模型小鼠前額葉HMGB1的表達(dá)；同時(shí)也說明持續(xù)乙醇攝入能夠通過抑制NRF2通路進(jìn)而激活HMGB1通路。

在對(duì)HMGB1受體表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn)，NRF2通路激動(dòng)劑能夠完全逆轉(zhuǎn)持續(xù)乙醇攝入引起的前額葉TLR4轉(zhuǎn)錄水平升高，但對(duì)TLR3的表達(dá)并無顯著影響；這一結(jié)果提示，激活NRF2通路能夠抑制HMGB1/TLR4途徑而非HMGB1/TLR3途徑；同時(shí)，在對(duì)炎性因子表達(dá)分析也發(fā)現(xiàn)，NRF2通路激動(dòng)劑能夠完全逆轉(zhuǎn)持續(xù)乙醇攝入引起的前額葉IL-1β轉(zhuǎn)錄水平升高，但TNF-α的表達(dá)并不受影響。既往研究顯示，在乙醇攝入炎性反應(yīng)過程中，TNF-α的表達(dá)與NLRP3/ASC炎性體表達(dá)密切相關(guān)[18]；結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在持續(xù)乙醇攝入模型中，TNF-α表達(dá)升高并非經(jīng)由NRF2/HMGB1途徑，而可能經(jīng)由炎性旁支途徑如調(diào)節(jié)NLRP3/ASC炎性體表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，以上結(jié)果也說明，持續(xù)乙醇攝入能夠通過抑制NRF2通路進(jìn)而激活HMGB1/TLR4通路，促進(jìn)其下游IL-1β表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)持續(xù)乙醇攝入能夠通過NRF2通路調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)，但對(duì)于NRF2調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)的機(jī)制尚不清楚；既往研究證實(shí)，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)參與乙醇對(duì)神經(jīng)元HMGB1表達(dá)的調(diào)控過程，但HDAC在NRF2通路調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)過程中的作用尚不明確，仍需進(jìn)一步分析[3]。

綜上所述，持續(xù)乙醇攝入能夠抑制小鼠前額葉NRF2通路活性；并通過抑制NRF2通路進(jìn)而激活HMGB1/TLR4通路，促進(jìn)其下游IL-1β表達(dá)。相關(guān)研究可為乙醇攝入相關(guān)疾病機(jī)制的闡述提供理論基礎(chǔ)。