朱 琨， 鄭桂華， 劉麗杰， 周 璐， 李珊珊， 范震宇， 鐘 玥， 尼 尼

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾161006；2. 哈爾濱遠(yuǎn)東理工學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150000)

草坪業(yè)在構(gòu)建山水林田湖草生命共同體和推動綠化城市發(fā)展進(jìn)程中愈來愈受到重視。草坪面積的不斷擴(kuò)大和集約化管理程度的提高，使得病害成為影響草坪質(zhì)量的重要因素之一[1]。無論冷季型草坪草或者暖季型草坪草建坪，白粉病都是草坪養(yǎng)護(hù)管理中的重點病害。白粉病主要危害葉片，導(dǎo)致新陳代謝異常，造成植株早衰和死亡[2]。

草地早熟禾(PoapratensisL.)作為重要牧草和觀賞草品種，具有成坪快、綠期長等優(yōu)點，被廣泛種植于世界各地，在我國北方已成為草坪綠化的主要草種之一。當(dāng)長時間遮蔭或通風(fēng)不足時，禾布氏白粉菌(ErysiphegraminisDC.ex Merat)的分生孢子常寄生于草地早熟禾葉表，葉肉細(xì)胞胞間有侵染菌絲，為形成葉表的串生分生孢子提供營養(yǎng)，使其感染白粉病。草地早熟禾的不同品種對白粉病的抗性存在差異[2]，選擇抗病性能強(qiáng)的品種建植草坪可降低病害發(fā)生。已有學(xué)者對植物的抗病性研究發(fā)現(xiàn)，葉片結(jié)構(gòu)和氣孔形態(tài)指標(biāo)與品種抗病性具有相關(guān)性，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為葉片組織結(jié)構(gòu)排列緊密、表皮厚、氣孔密度小可有效抵御病菌入侵，提高植物抗病性[3-8]。草地早熟禾的抗旱性研究指出，莖解剖結(jié)構(gòu)和葉表超微結(jié)構(gòu)證實存在結(jié)構(gòu)抗性，表皮細(xì)胞厚度、皮層厚度、木質(zhì)部厚度、導(dǎo)管直徑、維管束直徑與抗旱性呈正相關(guān)性[9-10]。但對草地早熟禾葉片結(jié)構(gòu)、氣孔形態(tài)指標(biāo)、乳突形態(tài)指標(biāo)與白粉病抗性的關(guān)系至今鮮有文獻(xiàn)報道。為此，本試驗采用掃描電鏡和石蠟切片技術(shù)，對具有不同白粉病抗性的草地早熟禾品種葉片表面結(jié)構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究，旨在闡明草地早熟禾葉片抗性結(jié)構(gòu)與其對白粉病抗性的關(guān)系，為篩選草地早熟禾抗病品種防治白粉病提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取3個草地早熟禾品種，分別為‘午夜2號’(Poapratensis‘Midnight Ⅱ’)、‘四季青’(Poapratensis‘All Spring’)、‘超級哥來德’(Poapratensis‘Ever Glade’)為供試材料，草種均由北京克勞沃集團(tuán)提供。病原菌為禾布氏白粉病菌(Erysiphegraminis)，在齊齊哈爾大學(xué)植物栽培實訓(xùn)基地采集并鑒定。

1.2 試驗設(shè)計

選擇飽滿、健康的草地早熟禾種子，培養(yǎng)基質(zhì)為園土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1，每個穴苗盤播種量為15 g·m-2，在25℃的溫室栽培管理，光周期為光照16 h/黑暗8 h；光照強(qiáng)度為6 000 lx；相對濕度為50%。當(dāng)苗長至30 d左右時，挑選長勢一致的植株，移栽到花盆(直徑20 cm，高15 cm)中，每盆20株，每個品種5盆，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。生長40 d后，將病葉上的白粉病菌孢子用毛筆輕輕刷入無菌水中，并向其中加入2%的吐溫-20表面活性劑，然后進(jìn)行噴霧接種。將配置好的孢子懸浮液均勻噴施在草地早熟禾葉片上，以葉面滿是霧滴但不滴落為宜，接種10 d后進(jìn)行病情調(diào)查和隨機(jī)取樣[2]。

1.3 觀測方法

1.3.1病情調(diào)查 病情指數(shù)借鑒田麗波等[4]的方法測定并計算。病級標(biāo)準(zhǔn)為0級：無病斑；1級：少量細(xì)小模糊的白粉斑，病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級：白粉層薄，病斑面積占整個葉面積的6%～10%；5級：白粉層較厚，病斑面積占整個葉面積的11%～20%；7級：白粉層厚，病斑面積占整個葉面積的21%～40%；9級：白粉層厚，病斑面積占整個葉面積的40%以上。

發(fā)病率(%)=發(fā)病葉片數(shù)/調(diào)差總?cè)~數(shù)×100%

白粉病抗性評價指標(biāo)參照董文科等[2]病情指數(shù)(Disease index，DI)劃分為：免疫(Immunity，I)：DI=0；高抗(High disease resistance，HR)：050。

1.3.2解剖結(jié)構(gòu)的觀察 參照李波等[11]的方法，在種植2個月后，每個品種隨機(jī)選取10盆，每盆各取 1片充分展開的第2功能葉，3個品種共取30個葉片，剪取葉片中間等寬部位，清水洗凈。固定于FAA固定液中，梯度酒精脫水后浸蠟包埋，用Leica RM 2135石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，番紅-固綠對染，中性樹膠封片，制成永久切片。各品種每次重復(fù)制3個樣片，每個樣片觀察5個視野。將制片在J-FL50i55i型熒光顯微成像系統(tǒng)下攝影并測量下列指標(biāo)：上、下表皮細(xì)胞的厚度，厚壁組織長度，維管束面積。

1.3.3葉片表面掃描電鏡觀察 將展開的第2功能葉剪下，用蒸餾水沖洗后，在葉片中部切成長0.5 cm小段，分別投入含戊二醛固定液瓶固定。制片前用0.1M磷酸緩沖液漂洗1 h，并更換漂洗液3～4次，然后在0℃～4℃下50%→70%→80%→90%酒精逐級脫水，每次靜止15 min，100%酒精洗脫2次，每次靜止15 min，脫水后把樣品浸入乙酸異戊酯中，室溫放置30 min后，用臨界點干燥器進(jìn)行干燥，將干燥樣品粘樣噴金，在JSM-5610LV掃描電鏡下，各品種每次重復(fù)制3個小段，每品種選取10個視野，每個視野中氣孔和乳突觀測的總樣本量大致相等。觀察并測量葉片的氣孔和乳突的長度、寬度、密度等指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，采取單因素方差分析和Duncan’s檢驗法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同草地早熟禾品種抗白粉病性比較

3個草地早熟禾品種葉片噴霧接種后，對其發(fā)病率、病情指數(shù)、抗性等級調(diào)查統(tǒng)計，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)(見表1)，3個供試品種白粉病發(fā)病率差異顯著(P<0.05)，發(fā)病率為18.08%～90.26%，‘午夜2號’發(fā)病率最低，其次為‘四季青’，‘超級哥來德’發(fā)病率最高；3個供試品種白粉病病情指數(shù)為9.73～68.76，‘午夜2號’病情指數(shù)最低，其次為‘四季青’，‘超級哥來德’病情指數(shù)最高；根據(jù)DI對白粉病抗性等級劃分，‘午夜2號’為MR，‘四季青’為MS，‘超級哥來德’為ES。

表1 不同草地早熟禾品種抗白粉病性評價

2.2 不同草地早熟禾品種的葉表氣孔比較

利用掃描電鏡對草地早熟禾葉片進(jìn)行表皮結(jié)構(gòu)觀察(圖1)，氣孔形狀近長方形，氣孔凹陷。由表2可知，3個草地早熟禾品種的氣孔長度和氣孔長寬比差異顯著(P<0.05)，均為：‘午夜2號’(MR)<‘四季青’(MS)<‘超級哥來德’(ES)。

圖1 草地早熟禾葉片表面氣孔

表2 草地早熟禾葉片氣孔各指標(biāo)測定

2.3 不同草地早熟禾品種的葉片乳突比較

利用掃描電鏡對草地早熟禾葉表結(jié)構(gòu)觀察(圖2)，發(fā)現(xiàn)有一定數(shù)量的硅質(zhì)乳突，呈圓柱狀，先端急尖；‘午夜2號’的乳突最大，‘四季青’的乳突次之，‘超級哥來德’的乳突最小。由表3可知，3個草地早熟禾品種葉片的乳突密度和乳突寬度差異顯著(P<0.05)，排列順序為：‘午夜2號’>‘四季青’>‘超級哥來德’。

圖2 草地早熟禾葉片表面乳突

表3 草地早熟禾葉片乳突各指標(biāo)測定

2.4 不同草地早熟禾品種的葉片橫切面結(jié)構(gòu)比較

草地早熟禾的葉片均由表皮、葉肉和葉脈3部分組成。從葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察(圖3)可知，草地早熟禾各品種的葉片上、下表皮均由一層細(xì)胞構(gòu)成；葉肉組織較簡單，由一層圍繞維管束排列的薄壁細(xì)胞組成；維管束均勻分布，周圍有排列松散的葉肉細(xì)胞，維管束兩端均有較發(fā)達(dá)的厚壁組織；在主脈附近分布大量水滴狀的泡狀細(xì)胞。

圖3 草地早熟禾葉的解剖結(jié)構(gòu)

由表4可知，3個草地早熟禾品種的葉片解剖結(jié)構(gòu)各指標(biāo)間存在差異，3個品種間上、下表皮厚度差異顯著(P< 0.05)，從大到小依次為‘午夜2號’>‘四季青’>‘超級哥來德’。

表4 葉的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)

3 討論與結(jié)論

氣孔是由一對保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成的植物葉表皮上的開孔，可控制植物氣體交換和水分蒸騰[12]。作為植物預(yù)先形成的天然開孔，氣孔也是許多病原菌入侵的通道。就氣孔密度與抗病性而言，不同學(xué)者持不同觀點。李海英等[7]對大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)葉片結(jié)構(gòu)與灰斑病抗性的研究結(jié)果表明，抗病品種葉片正面及葉片背面的氣孔密度明顯少于感病品種。但鄭偉等[8]的研究卻得到了截然相反的結(jié)論，蘋果(MaluspumilaMill.)品種的抗白粉病性越強(qiáng)，葉片氣孔密度越大。因為氣孔是預(yù)先形成的防預(yù)體系，其主要防預(yù)機(jī)制是依靠自身結(jié)構(gòu)及開閉運動來抵御病菌侵入，所以氣孔的密度和大小與品種的抗病性可能具有一定的相關(guān)性[13]。而杜蕙等[9]對8個葡萄(VitisviniferaL.)品種的葉片表皮氣孔與霜霉病的抗性研究中指出，氣孔的密度及大小與霜霉病的抗性無直接關(guān)系。本試驗通過室內(nèi)接種發(fā)病試驗發(fā)現(xiàn)，3個草地早熟禾品種對白粉病的抗性表現(xiàn)具有顯著性差異，其中‘午夜2號’為MR，‘四季青’為MS，‘超級哥來德’為ES。3個草地早熟禾品種的氣孔密度差異不顯著，表明3個草地早熟禾品種的氣孔密度與白粉病抗性無顯著相關(guān)性，但3個草地早熟禾品種的氣孔長度和氣孔長寬比都具有顯著性差異，表現(xiàn)為‘午夜2號’(MR)<‘四季青’(MS)<‘超級哥來德’(ES)。由此可知，3個草地早熟禾品種的氣孔長度和氣孔長寬比與白粉病抗性呈負(fù)相關(guān)性。造成這些差異的原因很可能是抗病性弱的草地早熟禾品種在白粉病菌的作用下，破壞了原生質(zhì)結(jié)構(gòu)，致使其通透性加大，導(dǎo)致其氣孔長度和氣孔長寬比加大[14]。

乳突是在長期進(jìn)化的過程中形成的葉細(xì)胞表面凸起的特殊抗旱結(jié)構(gòu)，有利于植物水分傳導(dǎo)和吸收[15]?？荑猍16]對叢蘚科植物葉細(xì)胞表面乳突的光鏡觀察，得出乳突是葉表面的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，可借助其差異性對屬間和種間的物種進(jìn)行劃分。當(dāng)白粉病菌侵染后，寄主針對白粉病菌的入侵部位形成乳突，位于寄主細(xì)胞壁與質(zhì)膜之間形狀如乳頭狀的細(xì)胞壁沉積物[17]。馬青等[18]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)寡聚糖誘導(dǎo)后的黃瓜(CucumissativusLinn.)，主要通過細(xì)胞壁加厚和產(chǎn)生多層次結(jié)構(gòu)的乳突，有效延遲和阻擋病原菌進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而提高黃瓜對白粉菌的抗性?？共∑贩N形成的乳突致密度高，而感病品種形成的乳突致密度低[19]。本試驗對葉表掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3個草地早熟禾品種均有圓柱狀、先端急尖的硅質(zhì)乳突。顯然，無論是抗病品種還是感病品種，受白粉病侵染均能形成乳突。3個品種的乳突長度差異不顯著，但乳突密度與寬度均差異顯著，大小順序均為：‘午夜2號’(MR)>‘四季青’(MS)>‘超級哥來德’(ES)?？梢?，乳突越密越大，品種抗性越強(qiáng)。這與王彰明的研究結(jié)果相一致，即乳突密度與抗病性呈正相關(guān)，進(jìn)一步推測乳突作為病菌侵染時的障礙，可有效地阻擋侵染或消耗侵染過程中能量物質(zhì)[19]。

葉片解剖結(jié)構(gòu)可以反映外界環(huán)境因子對植物的影響，以及植物自身對環(huán)境的適應(yīng)[20]。國內(nèi)外學(xué)者已通過葉表皮特征對不同植物進(jìn)行系統(tǒng)分類學(xué)研究[21-24]。大量研究證實，葉片解剖結(jié)構(gòu)對了解植物遺傳基礎(chǔ)差異具有重要意義[25-28]。葉片解剖結(jié)構(gòu)與白粉病抗性也存在相關(guān)性，戎福喜等[29]對黃瓜葉片橫切面顯微形態(tài)組織結(jié)構(gòu)觀察中發(fā)現(xiàn)，突變體比野生型葉片上、下表皮細(xì)胞層均加厚，其對白粉菌抗性增強(qiáng)。田麗波等[4]研究表明，苦瓜(MomordicacharantiaL.)葉片下表皮厚度與白粉病抗性呈正相關(guān)。本試驗中3個草地早熟禾品種葉片上、下表皮厚度依次為‘午夜2號’(MR)>‘四季青’(MS)>‘超級哥來德’(ES)。這與上述學(xué)者的研究結(jié)果相一致，可見，葉片表皮細(xì)胞可抵御病菌入侵，其厚度增加有利于提高白粉病抗性[4]。

綜上所述，草地早熟禾葉片表面結(jié)構(gòu)和解剖結(jié)構(gòu)與抗白粉病有關(guān)，其氣孔長度、氣孔長寬比、乳突密度、寬度、葉片上、下表皮厚可作為評價草地早熟禾抗白粉病較理想的指標(biāo)。抗性品種表現(xiàn)出氣孔長度小，氣孔長寬比小，上下表皮厚度大，且表皮上分布的乳突密而大等防御白粉病菌侵染的結(jié)構(gòu)特點。