梁永兵，李海北，程春燕，師丹陽，陳鄭珊，楊棟，孫棟良，邵一帆，李君文，金敏

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津市環(huán)境與食品安全風(fēng)險監(jiān)控技術(shù)重點實驗室，天津 300050

抗生素在治療人類傳染病方面做出了巨大貢獻，同時也在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)中應(yīng)用廣泛[1-2]，但隨之而來的抗生素耐藥性問題也越來越嚴重。世界衛(wèi)生組織公布了2019年全球健康面臨的最大威脅清單，細菌抗生素耐藥問題位列第五，而抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作為細菌產(chǎn)生抗生素耐藥性的重要遺傳基礎(chǔ)，已被定義為一種新型環(huán)境污染物并對人類健康產(chǎn)生嚴重威脅[3]。尤其近幾年來，隨著耐萬古霉素腸球菌等超級耐藥細菌(super antibiotic resistance bacteria, SARB)不斷涌現(xiàn)，其超級耐藥基因(super antibiotic resistance genes, SARGs)如blaNDM-1和mcr-1在水中的污染也不容小覷。Khan等[4]在印度和巴基斯坦管網(wǎng)末梢水細菌中發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類基因blaNDM-1，而在中國和美國等水樣中檢測出耐多粘菌素類基因mcr-1，且該基因能夠通過飲用水污染途徑定植到小鼠腸道菌群；曹振華等[5]也在南京地區(qū)自來水廠出水細菌中檢出mcr-1和blaNDM-1。

自然環(huán)境中的SARGs主要有細胞內(nèi)SARGs(intracellular SARGs, iSARGs)與細胞外SARGs(extracellular SARGs, eSARGs)2種存在形式。其中，iSARGs位于細菌內(nèi)部，可通過基因垂直傳播或接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)等水平轉(zhuǎn)移方式傳播抗生素耐藥性，而eSARGs獨立存在于環(huán)境中，是由菌體分泌或者死亡裂解后釋放到外部環(huán)境中的游離DNA，具有水平轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)化的風(fēng)險[6]，如Jin等[7]發(fā)現(xiàn)，消毒過程中死亡的細菌釋放的游離ARGs可轉(zhuǎn)化消毒損傷細菌，從而促進細菌間ARGs的傳播與擴散。因此，不管iSARGs還是eSARG，均對水中SARB的傳播與擴散具有重要作用，而生活飲用水中iSARGs和eSARG污染，均可能對人類健康造成風(fēng)險。2019年，我們首次報告管網(wǎng)末梢水除了存在sul1和sul2等胞內(nèi)ARGs(intracellular ARGs, iARGs)外，還有相關(guān)胞外ARGs(extracellular ARGs, eARGs)污染[8]，然而，截止目前，還未見管網(wǎng)末梢水中有關(guān)eSARGs的污染特征研究。

基于此，本文以天津市中心城區(qū)的集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水為研究對象，通過分析包括blaNDM-1、mcr-1、blaKPC和vanA等SARGs在內(nèi)的15種ARGs的污染現(xiàn)狀，闡明天津市集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs污染特征。本研究將為今后生活飲用水ARGs的風(fēng)險評估及其控制奠定基礎(chǔ)，也為今后能將ARGs監(jiān)測措施和風(fēng)險管理策略納入公共衛(wèi)生決策系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器與試劑

DN-ZY正壓過濾器(海寧市能大過濾設(shè)備有限公司)，BT100-2J蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)，2-16KL臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)，ViiA 7Dx熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，2100P便攜式濁度分析儀(美國Hach公司)，HQ40d便攜式測定儀(美國Hach公司)，DR1900便攜式分光光度計(美國Hach公司)，HH.Bll-500BS型恒溫培養(yǎng)箱(天津市天宇實驗儀器有限公司)；水相微孔過濾膜(北京市北化黎明膜分離技術(shù)有限責(zé)任公司)，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(瑞士Roche公司)，F(xiàn)ast DNA Spin Kit for Soil(美國MP Bio公司)，DNA純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、m-Endo培養(yǎng)基、MFC培養(yǎng)基和MUG瓊脂培養(yǎng)基等購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 水樣采集

根據(jù)天津中心城區(qū)的6個行政區(qū)域分布，從各區(qū)域中隨機選取一個采樣點進行管網(wǎng)末梢水樣采集(圖1)，水樣采集體積為20 L，采樣時間為2020年5月，每個采樣點采集3次。水樣采集后，冷藏條件下迅速運回實驗室開展實驗。

圖1 天津市中心城區(qū)采樣點分布圖注：采樣時間及地點如下，采樣點① 2020年5月6、13和20日8:00—10:00，天津市和平區(qū)大理道；采樣點② 2020年5月6、13和20日10:00—12:00，天津市河西區(qū)樂園道；采樣點③ 2020年5月6、13和20日14:00—16:00，天津市河?xùn)|區(qū)成林道；采樣點④ 2020年5月8、15和22日8:00—10:00，天津市河北區(qū)黃緯路；采樣點⑤ 2020年5月8、15和22日10:00—12:00，天津市紅橋區(qū)芥園道；采樣點⑥ 2020年5月8、15和22日14:00—16:00，天津市南開區(qū)水上公園東路。Fig. 1 Sampling sites of Tianjin city centerNote: Sampling time and location were as follows: Sampling site ① 8:00—10:00 on May 6th, 13th and 20th, 2020, Dali Road, Heping District, Tianjin; Sampling site ② 10:00—12:00 on May 6th, 13th and 20th, 2020, Leyuan Road, Hexi District, Tianjin; Sampling site ③ 14:00—16:00 on May 6th, 13th and 20th, 2020, Chenglin Road, Hedong District, Tianjin; Sampling site ④ 8:00—10:00 on May 8th, 15th and 22nd, 2020, Huangwei Road, Hebei District, Tianjin; Sampling site ⑤ 10:00—12:00 on May 8th, 15th and 22nd, 2020, Jieyuan Road, Hongqiao District, Tianjin; Sampling site ⑥ 14:00—16:00 on May 8th, 15th and 22nd, 2020, Water Park East Road, Nankai District, Tianjin.

1.3 水質(zhì)理化及微生物指標的檢測

參照《生活飲用水標準》(GB/T 5749—2006)[9]和《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)[10]對自來水的理化及微生物指標進行檢測。濁度采用便攜式濁度分析儀測定；pH值和電導(dǎo)率由HQ40d便攜式測定儀測定；余氯和氨氮采用DR1900便攜式分光光度計測定；高錳酸鉀指數(shù)利用DRB200型數(shù)字反應(yīng)器(美國Hach公司)和DR1900便攜式分光光度計檢測。菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌分別利用營養(yǎng)瓊脂、m-Endo培養(yǎng)基、MFC培養(yǎng)基和MUG瓊脂培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)和計數(shù)。每組做3個平行實驗。

1.4 細菌的富集及iARGs的提取

細菌的富集及iARGs的提取方法參照文獻[11]，在正壓過濾器中裝入孔徑0.22 μm的濾膜，利用蠕動泵將20 L水勻速(50 mL·min-1)通過過濾器后，將濾膜取出剪碎，并用100 mL的3%牛肉膏洗脫液浸泡，置于磁力攪拌器中攪拌30 min(4 ℃)后，將細菌懸液收集到50 mL的離心管中；離心(8 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，棄上清；向沉淀中加入10 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)緩沖液重懸，用Fast DNA Spin Kit for Soil提取DNA后，置于-80 ℃保存待測。

1.5 eARGs的富集與純化

參照文獻[6]的方法，制備核酸吸附顆粒并利用核酸吸附-洗脫方法收集胞外游離核酸。以PBR322質(zhì)粒作為內(nèi)參(終濃度為20 GC·mL-1)，加入到上述過濾后的管網(wǎng)末梢水中，以50 mL·min-1流速通過裝有80～90 g核酸吸附顆粒的過濾柱(直徑5 cm、高30 cm)，用300 mL洗脫液(15 g·L-1氯化鈉、30 g·L-1胰蛋白胨、15g·L-1牛肉粉、3.75 g·L-1甘氨酸、0.28 g·L-1氫氧化鈉，pH=9.3±0.2)進行洗脫。將收集的洗脫液通過PES微孔膜過濾器(φ 0.22 μm，美國Milipore公司)后，加入同等體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置16 h；離心(10 000 r·min-1，4 ℃)10 min后，棄上清；用體積分數(shù)為70%的乙醇水溶液重懸沉淀并離心(10 000 r·min-1，5 min，4 ℃)；棄上清后靜置數(shù)分鐘，使乙醇充分揮發(fā)；加入1 mL無菌Tris-EDTA緩沖液(pH=8.0)混勻。利用用DNA純化試劑盒進一步純化胞外核酸后，置于-80 ℃保存待測。

1.6 ARGs的定量檢測

利用熒光定量PCR技術(shù)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)檢測15種具有代表性的不同類別ARGs(表1)，其qPCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及標準曲線的建立參見文獻[11]。引物和ARGs標準品由上海生工有限公司合成，每個基因做3次平行檢測并設(shè)有陰性對照(DEPC水代替樣品模板)和陽性對照(相應(yīng)ARGs標準品代替樣品模板)。

表1 本研究所用引物[11-15]Table 1 The primers used in this study[11-15]

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析。其中，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性要求的用Paired-Samplet-test檢驗，數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性要求的用Wilcoxon檢驗，比較多個獨立樣本的分布差異用Kruskal-Wallis H檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的水質(zhì)指標情況

所有待檢管網(wǎng)末梢水樣的水質(zhì)指標均符合我國生活飲用水衛(wèi)生標準(GB/T 5750.12—2006)，其中濁度0.1～0.8 NTU、pH 7.8～8.4、余氯0.3～0.7 mg·L-1、電導(dǎo)率278～385 μs·cm-1、氨氮0.35～0.45 mg·L-1、高錳酸鹽指數(shù)0.50～2.85 mg·L-1、菌落總數(shù)均≤1 CFU·mL-1，總大腸菌群、耐熱大腸菌群和大腸埃希氏菌均未檢出。

2.2 集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs檢出頻率

在待檢的15種ARGs中，除blaKPC未被發(fā)現(xiàn)外，其余ARGs均在管網(wǎng)末梢水中檢出(表2)。其中，iARGs共檢測出13種，且mcr-1、vanA、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA、dfrA1和katG等10種ARGs在所有水樣中均被檢出，而rpoB1、ermB和catA1只在部分水樣中檢出，qnrA和blaKPC一直未檢出。對于eARGs，共檢測出12種，其中，mcr-1、vanA、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA和dfrA1等8種的檢出率為100%，ermB、katG和blaKPC一直未檢出，而qnrA、blaNDM-1、rpoB1和catA1等4種ARGs僅在部分水樣中檢測出。因此，天津市管網(wǎng)末梢水殘留細菌的體內(nèi)外均存在mcr-1、vanA、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA、dfrA1、rpoB1和catA1等11種ARGs污染，其中vanA、mcr-1和blaNDM-1等SARGs尤為值得注意，它們以iARGs和eARGs這2種形態(tài)存在于所有水樣，另外，ermB和katG僅出現(xiàn)在iARGs中，而qnrA僅出現(xiàn)在eARGs中。

2.3 天津中心城區(qū)集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs污染特征

天津市中心城區(qū)集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs濃度水平如圖2所示，其中，iARGs的相對濃度是水中iARGs的絕對濃度與16S rDNA絕對濃度的比值。由圖2可知，aadA、blaTEM和sul1是天津市管網(wǎng)末梢水的主要ARGs，而在SARGs陽性水樣中，vanA和mcr-1濃度較高。對于iARGs，aadA相對濃度和絕對濃度均最高(圖2(a)～2(b))，平均值分別為0.16 GC·L-1和2.6 ×104GC·L-1；其次為blaTEM和sul1，絕對濃度平均值分別為2.4×104GC·L-1和1.8×104GC·L-1。對于eARGs，aadA絕對濃度同樣最高(圖2(c))，平均值為7.4×103GC·L-1，其次為blaTEM(平均值6.5×103GC·L-1)以及sul1(平均值4.2×103GC·L-1)。同時，tetM、tetA、dfrA1、vanA和mcr-1也是天津市管網(wǎng)末梢水中含量較高的基因，各基因的胞內(nèi)濃度平均值為1.9×103～6.9×103GC·L-1，而胞外濃度平均值為2.7×102～1.8×103GC·L-1，以上8種基因總濃度分別占iARGs和eARGs的97.25%和99.18%。

通過對比分析，天津市管網(wǎng)末梢水的iARGs總絕對濃度為eARGs的3.8倍(圖2(d))。同時，還發(fā)現(xiàn)除了qnrA只在eARGs中被檢出外，同一種ARGs的胞內(nèi)絕對濃度均高于胞外(P<0.05)。如blaNDM-1的胞內(nèi)絕對濃度平均值為1.2×103GC·L-1，而胞外含量極低，平均值僅為2.0 GC·L-1；mcr-1的胞內(nèi)絕對濃度平均值為4.2×103GC·L-1，而胞外濃度僅為266 GC·L-1。

圖2 天津市中心城區(qū)集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs濃度(n=18)Fig. 2 The concentration of ARGs in the terminal tap water in city center of Tianjin (n=18)

2.4 天津中心城區(qū)不同區(qū)域集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs污染特征

如圖3所示，各區(qū)水中iARGs總絕對濃度為5.8×104～1.1×105GC·L-1，且各區(qū)之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3(a))，但其相對濃度卻有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖3(b))，其中，河西區(qū)iARGs相對濃度最高，達到0.99；紅橋區(qū)最低，河西區(qū)為紅橋區(qū)8倍。同時，不同區(qū)域水中檢測出的ARGs種類不同。其中，vanA、mcr-1、blaNDM-1、aadA、blaTEM、sul1、tetM、tetA和dfrA1等在各區(qū)水樣均能檢出，rpoB1僅在河?xùn)|區(qū)、河北區(qū)和紅橋區(qū)檢出；ermB僅在河北區(qū)檢出；catA1僅在河西區(qū)檢出。

對于eARGs，各區(qū)總絕對濃度為9.9×103～3.6×104GC·L-1，且各區(qū)之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3(c))，但不同區(qū)域的ARGs種類不盡相同。aadA、blaTEM、sul1、tetM、mcr-1、vanA、tetA和dfrA1等在各區(qū)水樣均能檢出，而qnrA在和平區(qū)、河西區(qū)和河?xùn)|區(qū)檢出；blaNDM-1在和平區(qū)、河西區(qū)和河北區(qū)檢出；rpoB1在和平區(qū)、河西區(qū)和河?xùn)|區(qū)檢出；catA1僅在河?xùn)|區(qū)檢出。

圖3 天津市中心城區(qū)不同區(qū)域集中供應(yīng)管網(wǎng)末梢水的ARGs濃度(n=3)Fig. 3 The concentration of ARGs in the terminal tap water in various districts of city center of Tianjin (n=3)

3 討論(Discussion)

管網(wǎng)末梢水存在iARGs的污染，其原因可能有以下幾點。(1)水源水本身普遍存在ARGs污染。天津城市供水主要靠引江水和灤水[16]。Zhang等[17]對15種抗生素及5種ARGs進行檢測，在長江采集的所有水樣中均檢出。王若楠等[18]從長江水分離出mcr-1攜帶菌，且其耐多粘菌素的半抑制濃度較高。水源水ARGs污染會增加其在管網(wǎng)末梢造成污染的風(fēng)險[19]。(2)自來水存在的抗生素污染促進了細菌產(chǎn)生抗生素耐藥性。張新波等[20]對天津市供水系統(tǒng)抗生素分布特征進行研究，發(fā)現(xiàn)無論是自來水廠出水還是管網(wǎng)末梢水，都普遍存在6類10種抗生素的污染。(3)自來水廠處理工藝會導(dǎo)致ARGs富集。天津市自來水廠主要采用氯化消毒，而越來越多的研究表明，氯化消毒在一定條件下加劇ARGs污染，如Shi等[21]發(fā)現(xiàn)氯化消毒后，水中β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類等ARGs相對濃度上升，Jin等[7]報道，氯化消毒可以通過促進質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化而加強ARGs跨細菌種屬傳播。(4)細菌消毒劑抗性/抗生素耐藥性的共選擇作用。侯愛明等[22-23]從氯消毒飲用水系統(tǒng)中收集了150株耐氯存活細菌，發(fā)現(xiàn)80%氯損傷非苛養(yǎng)細菌對抗生素具有多重耐藥性，其機制可能與細胞膜藥物外排泵表達升高有關(guān)。(5)供水管網(wǎng)生物膜對ARGs的富集。生物膜細菌通常會分泌大量聚合物，使管網(wǎng)末梢水中的微生物富集，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在共同抵御不良外界環(huán)境的同時更加大了ARGs水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[24]。(6)管網(wǎng)新舊、采樣點與水廠距離等原因也會導(dǎo)致不同區(qū)域管網(wǎng)末梢水ARGs污染程度不同[25-26]。

同時，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)管網(wǎng)末梢水普遍存在eARGs污染。eARGs是耐藥菌活體分泌或死后釋放的一種污染物，它們可通過自然轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式傳遞抗生素耐藥性，且不需要活體供體細胞[27]。同時，消除這些eARGs比殺死抗生素耐藥菌困難得多[28]。如Roller等[29]報道，即使被二氧化氯滅活了流感嗜血桿菌(滅活率為6個對數(shù))，細胞內(nèi)DNA仍是完整的膠狀。Jin等[7]發(fā)現(xiàn)，盡管耐藥菌在氯化作用后已經(jīng)有效死亡，但它們釋放的eARGs仍保留生物學(xué)活性并可通過轉(zhuǎn)化進入其他細菌，而且，只有在超高劑量消毒劑使用情況下才能使之完全降解。鑒于eARGs易傳播和難降解的特點，管網(wǎng)末梢水中的eARGs污染不容忽視。

值得關(guān)注的是，本研究還發(fā)現(xiàn)管網(wǎng)末梢水中存在iARGs和eARGs這2種形態(tài)的vanA、mcr-1和blaNDM-1等SARGs。vanA是耐萬古霉素的ARGs，同時還可使細菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素和替考拉寧耐藥性[30]，這是較早發(fā)現(xiàn)的多重耐藥SARGs。mcr-1和blaNDM-1是近年來發(fā)現(xiàn)的新型ARGs，前者具有被稱為抵御細菌耐藥性“最后一道防線”的多黏菌素類抗生素的耐藥能力，后者可使細菌表達β-內(nèi)酰胺類抗生素水解酶，對除多黏菌素外的所有抗生素均有耐藥性[5]，故攜帶mcr-1和blaNDM-1的耐藥菌往往無藥可治。研究表明，SARGs能夠通過飲用水污染途徑定植到小鼠腸道菌群[4]，再加上SARGs兼具易傳播、難降解和多重耐藥的特點，水中SARGs污染將對人類健康產(chǎn)生潛在威脅，因此，管網(wǎng)末梢水中SARGs帶來的健康風(fēng)險及公共衛(wèi)生危害應(yīng)當引起我們的關(guān)注與重視，這也對提高國家飲用水標準、改進自來水廠處理工藝帶來了挑戰(zhàn)。

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