許燕，孫韶華，逯南南，孫莉，趙清華，賈瑞寶

山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，濟南 250100

世界衛(wèi)生組織(WHO)定義內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指能改變機體內(nèi)分泌功能，并對生物體、后代或種群產(chǎn)生不良影響的外源性物質(zhì)或混合物[1]。一些EDCs能作為激素的模擬物或者阻滯劑直接作用于機體的激素受體，還有一些能直接作用于控制激素向其靶細胞或者組織傳遞的蛋白質(zhì)，從而對人類或者動物的生殖健康、性別比例和神經(jīng)發(fā)育等產(chǎn)生影響，引起甲狀腺、腎上腺、代謝紊亂和免疫功能障礙等相關(guān)疾病。目前，已知包含農(nóng)藥、阻燃劑、塑料制品、個人護理品、重金屬、增塑劑和抗氧化劑等在內(nèi)的，超過800種化學(xué)物質(zhì)具有內(nèi)分泌干擾特性[2]。隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，各類新型化合物的合成以及新型污染物的排放，數(shù)十萬種合成化學(xué)品中只有極小部分被評估為內(nèi)分泌干擾活性，人類已經(jīng)完全暴露于多種EDCs廣泛存在的環(huán)境中。已有研究表明，EDCs廣泛分布于水生環(huán)境，可能對水生生物和人類健康構(gòu)成威脅[3-4]。

由于EDCs種類繁多且多具有低濃度活性，相互之間可能產(chǎn)生附加或協(xié)同作用，環(huán)境EDCs篩查方法中，儀器分析法雖然能識別和量化已知的特定環(huán)境EDCs，但具有前處理復(fù)雜、儀器昂貴和耗時久等缺點[5]。生物分析法因其檢測費用低、耗時短、能測定復(fù)雜化合物的綜合毒性等優(yōu)點，在篩查測定環(huán)境EDCs時，與儀器分析法相比有顯著的優(yōu)勢?；瘜W(xué)誘導(dǎo)熒光素酶表達基因法(chemically activated luciferase gene expression, CALUX)是一種體外生物測試法，通過測定重組哺乳動物細胞暴露于污染物所產(chǎn)生的熒光強度，結(jié)合毒性當量物質(zhì)的響應(yīng)值，來評價污染物的綜合毒性效應(yīng)。美國、歐盟、日本等國家和組織已將CALUX生物測定法指定為官方篩選方法。近年來，CALUX技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境(土壤、大氣和水)[6-7]、食品和人類血清[8-9]等EDCs的篩查測定。

小清河是濟南市城市河流的兩大水系之一，是濟南市區(qū)內(nèi)唯一的防洪除澇和排污河道，小清河(濟南段)流域主要包括槐蔭區(qū)、天橋區(qū)、市中區(qū)、歷下區(qū)、歷城區(qū)和章丘市，從辛豐莊出濟南界，長70.3 km，匯流面積2 873.93 km2，絕大多數(shù)支流集中在主干河道南岸，成單側(cè)羽毛狀分布，基本上屬于雨源型山溪河流，北岸支流較少，均屬平原型坡水河流(圖1)。

圖1 小清河主要支流采樣點分布圖Fig. 1 Distribution map of the main tributaries of Xiaoqing River

本文聚焦小清河(濟南段)的主要支流，采用CALUX生物測定法深度調(diào)研各支流雌激素類、二噁英類、雄激素類和腎上腺皮質(zhì)激素類等4類典型EDCs的污染現(xiàn)狀，通過為期1年的調(diào)查研究，明確了各支流4類EDCs的含量水平，揭示了不同EDCs的時空分布規(guī)律，為評估小清河支流EDCs污染風(fēng)險提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

儀器與試劑：LB960型微孔板式化學(xué)分光檢測儀(德國Berthold Centro公司)；AC2-4S1型生物安全柜(新加坡ESCO公司)；HERA cell 150i型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；CKX41型組織培養(yǎng)用顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；Auto SPE-06C型全自動固相萃取儀(美國睿科公司)；正己烷、乙酸乙酯為色譜純，美國Dikmapure公司；二甲基亞砜(DMSO)為分析純，美國Sigma公司。

細胞系購自荷蘭Biodetection Systerms B.V.(BDS)公司，其中，DR CALUX細胞是通過基因工程，使其在暴露于Ah受體(AhR)激動劑時產(chǎn)生熒光素酶的大鼠肝癌細胞(H4IIe)，AhR激動劑包括二噁英化合物、類二噁英多氯聯(lián)苯化合物和呋喃化合物等。

ER CALUX細胞是通過基因工程，使其在暴露于雌激素受體(ER)激動劑時產(chǎn)生熒光素酶的人類乳腺癌細胞(T-47D)，ER激動劑包括雌激素化合物或類雌激素化合物。

GR CALUX細胞是通過基因工程，使其在暴露于腎上腺皮質(zhì)激素受體(GR)激動劑時產(chǎn)生熒光素酶的人類成骨骨癌細胞(U2-OS)，GR激動劑包括腎上腺皮質(zhì)激素化合物或類腎上腺皮質(zhì)激素化合物。

AR CALUX細胞是通過基因工程，使其在暴露于雄激素受體(AR)激動劑時產(chǎn)生熒光素酶的人類成骨骨癌細胞(U2-OS)，AR激動劑包括雄激素化合物或類雄激素化合物。

標準物質(zhì)濃度系列(2,3,7,8-四氯二苯并-對-二噁英、雌二醇、二氫睪酮、地塞米松)購自荷蘭BDS公司；細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Oasis HLB固相萃取柱購自美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

2017年9月—2018年8月，每月對小清河(濟南段)的LS、XJ、GS、XL、DL、LY、HC和DX等8條南岸主要支流進行一次水樣樣本采集，采樣瓶須使用氫氧化鈉溶液進行充分清洗，并經(jīng)無水乙醇漂洗晾干，水樣采集后需在4 ℃條件下運輸至實驗室，然后在72 h內(nèi)完成過濾和前處理操作。經(jīng)前處理后，利用CALUX生物測定法分別測試二噁英類、雌激素類、腎上腺皮質(zhì)激素類和雄激素類的含量水平。

1.2.2 樣品的前處理

測定二噁英類的樣品前處理：已混勻的水樣加入正己烷，用振蕩器震蕩萃取，靜置使兩相分層，將上層液相轉(zhuǎn)入玻璃試管中，以平緩的氮氣使試管中的正己烷蒸發(fā)。重復(fù)以上液液萃取2次后，將濃縮液通過硫酸硅膠柱，完成對有機物、脂肪和不穩(wěn)定多環(huán)芳烴等的氧化。凈化后的提取液以平緩的氮氣吹干，加入DMSO溶液，-20 ℃保存，以待細胞分析測定。

測定雌激素類、雄激素類和腎上腺皮質(zhì)激素類的樣品前處理：樣本混勻后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，經(jīng)已活化的HLB固相萃取柱富集，用乙酸乙酯洗脫固相萃取柱3次，以平緩的氮氣濃縮洗脫液，氮吹后加入DMSO溶液，-20 ℃保存，以待細胞分析測定。

1.2.3 CALUX法檢測

根據(jù)ISO17025認證推薦的標準操作方法[10]進行檢測，首先，將細胞懸浮液按一定的稀釋比例，植板于96孔微孔板，孵育16 h。然后，無菌條件下轉(zhuǎn)移出微孔板的培養(yǎng)基，將預(yù)先制備的含特定劑量樣本的培養(yǎng)基、含特定濃度劑量的標準參照物的培養(yǎng)基填充至96孔板，孵育24 h后，從微孔板中移出所有培養(yǎng)基，每孔加入30 μL細胞消散試劑，測定螢光素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對照標準參照物系列的熒光強度，使用數(shù)據(jù)分析軟件制作劑量-響應(yīng)曲線，得出樣品中不同EDCs的當量值，即分別使用17β-雌二醇(E2)、二氫睪酮(DHT)、地塞米松(Dex)、2,3,7,8-四氯二苯并-對-二噁英(2,3,7,8-TCDD)來表征雌激素類、雄激素類、腎上腺皮質(zhì)激素類和二噁英類的內(nèi)分泌活性的濃度。

數(shù)據(jù)分析時，低于檢出限的測試結(jié)果，統(tǒng)一賦為檢出限一半的值，用于計算平均值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小清河(濟南段)主要支流EDCs含量水平及分布特征

2.1.1 二噁英類

結(jié)果表明，在為期1年的調(diào)研周期內(nèi)，小清河(濟南段)8條支流的二噁英類毒性當量濃度范圍為

圖2 不同季節(jié)二噁英類含量水平Fig. 2 Dioxin levels in different seasons

由圖3可知，8條支流的年平均毒性當量濃度為0.020～0.040 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，二噁英類的含量分布較為平均，僅一條河流二噁英類含量高于美國環(huán)境保護局(US EPA)飲用水中二噁英含量標準0.030 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，本研究調(diào)研小清河的支流主要為城市內(nèi)部泄洪的季節(jié)性河流，因此得出調(diào)研支流的二噁英類污染風(fēng)險較低。

2.1.2 雌激素類

由圖3可知，8條支流雌激素類的年平均毒性當量濃度為0.007～0.050 ng E2-eq·L-1，除HC支流的年平均毒性當量濃度達0.050 ng E2-eq·L-1外，其余支流雌激素類活性濃度均在0.020 ng E2-eq·L-1左右。

由圖4所示，雌激素類檢測結(jié)果表明，2017年9月—2018年8月，LS、XJ和DX等3條支流全年未檢測到雌激素類活性(

圖4 雌激素類分布特征Fig. 4 Characteristics of estrogen distribution

2.1.3 腎上腺皮質(zhì)激素類

腎上腺皮質(zhì)激素類的年平均毒性當量濃度為1.8～9.6 ng Dex-eq·L-1，由圖3可知，有4條支流年平均腎上腺皮質(zhì)激素類毒性當量低于方法檢出限(LOD=3.9 ng Dex-eq·L-1)，其余支流年平均腎上腺皮質(zhì)激素類毒性當量濃度范圍為4.4～9.6 ng Dex-eq·L-1。

測試結(jié)果表明，XJ支流全年未檢測到腎上腺皮質(zhì)激素類活性(

圖5 腎上腺皮質(zhì)激素類分布特征Fig. 5 Characteristics of glucocorticoid distribution

2.1.4 雄激素類

雄激素類除2018年2—3月在DL、XL和GS支流各檢出一次外，其余均未檢測到雄激素類活性(

2.2 小清河(濟南段)支流EDCs對水環(huán)境污染的貢獻

由圖3和圖6可知，在調(diào)研期內(nèi)，小清河(濟南段)的主要支流都受到了4類EDCs不同程度的污染，位于居民區(qū)和商業(yè)區(qū)的GS、DL和XL等3條支流均檢測到了4類EDCs活性，由地下泉水匯流而成的HC和LY支流檢測到了除雄激素類之外的其余3類EDCs活性，LS和DX支流檢測到了二噁英類和腎上腺皮質(zhì)激素類活性，XJ支流只檢測到二噁英類活性。

圖3 二噁英類、雌激素類和腎上腺皮質(zhì)激素類年平均含量分布注：二噁英的含量單位為ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1；雌激素的含量單位為E2-eq·L-1。Fig. 3 Average annual distribution of dioxin, estrogen and glucocorticoidNote: The unit of dioxin content is ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1; the unit of estrogen content is E2-eq·L-1.

由圖6可知，CALUX生物分析法測定的小清河(濟南段)支流中每類EDCs的毒性當量對4類EDCs的貢獻分析結(jié)果顯示，腎上腺皮質(zhì)激素類、二噁英類、雌激素類和雄激素類等4類EDCs中，對水環(huán)境EDCs污染貢獻最大的是腎上腺皮質(zhì)激素類，占比均達90%以上。

圖6 4種內(nèi)分泌干擾物(EDCs)對各支流水環(huán)境污染的貢獻Fig. 6 Contribution of four endocrine disrupting chemicals (EDCs) to river water environment

3 討論(Discussion)

3.1 二噁英類

有文獻報道，環(huán)境中二噁英類的主要來源是焚燒的大氣沉積[12]，這可能是二噁英類在小清河(濟南段)主要支流中分布較為平均的原因。近年來針對環(huán)境二噁英污染的研究，大多集中在大氣[5]、土壤[13]的含量篩查，利用生物方法對水環(huán)境中二噁英類的研究，多以地表水[14]、污水[15]和沉積物[16-18]為研究對象，Shi等[19]使用EROD生物測試法評價了我國長江、淮河和太湖流域的二噁英類含量為0.062～0.116 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1；黃楚琴等[20]應(yīng)用酵母報道基因系統(tǒng)，檢測了我國廣州市內(nèi)河涌水體二噁英類含量范圍為0.0136～50.1890 ng·L-1，污染較為嚴重的可能原因是工業(yè)排污和大量的水陸交通尾氣排放，珠江水體二噁英類當量范圍為0.0130～6.2210 ng·L-1。我國濟南市河流夏季處于豐水期，由于降水量大且調(diào)研支流多為泄洪河道，大氣中含二噁英類的顆粒物隨著雨水匯入各支流，此類物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定且難以被降解，這可能是各支流夏季二噁英類含量水平高于其他三季的主要原因。對比近年來我國南方重要流域的二噁英類含量報道，小清河(濟南段)主要支流受二噁英類的污染程度較低。

3.2 雌激素類

眾多學(xué)者使用生物分析法對各國家河流的雌激素類毒性含量進行了測試，如表1所示，比較發(fā)現(xiàn)，小清河(濟南段)主要支流雌激素類的含量與文獻報道的其他國家河流相比[10,17,19,21-24]，含量水平相對較低，說明雌激素類的污染風(fēng)險較低。

表1 各國河流水中雌激素類活性的相關(guān)研究Table 1 Some research about estrogen activity in river waters of different countries

有學(xué)者證實了細菌在需氧和厭氧條件下，具有降解環(huán)境中雌激素類固醇的作用[25-26]，Vandermarken等[17]從體外生物降解實驗中，也發(fā)現(xiàn)河流中天然存在的細菌群落對雌激素類EDCs具有一定的自凈能力。本研究所調(diào)研河流多具有城市泄洪功能，濟南夏秋兩季雨水豐盛，河流中天然細菌群落較為豐富，細菌群落對雌激素類EDCs的天然降解及較大雨水量的自然稀釋，可能是夏秋季節(jié)雌激素類活性低的原因。此外，有研究表明，雌激素類大多來自城市、農(nóng)業(yè)或家庭排放的小分子[27-28]，5條檢出雌激素類的支流分布在人口較為密集的居民區(qū)，因此，家庭廢水排放對河流中雌激素類的污染不容忽視。

3.3 腎上腺皮質(zhì)激素類

近年來，應(yīng)用CALUX法篩查評估地表水、河流中腎上腺皮質(zhì)激素類的含量也見諸報道。已有研究報道了捷克共和國和瑞士的河流、萊茵河流域(荷蘭境內(nèi)的部分)、荷蘭某地表河流的腎上腺皮質(zhì)激素類含量水平為

一定量的腎上腺皮質(zhì)激素，主要通過哺乳動物尿液排出體外，通過污水處理廠或潮濕天氣徑流排放到水生環(huán)境中，并成為水生環(huán)境中潛在的污染物[33]。而本研究中DX河河道最長，流經(jīng)區(qū)域復(fù)雜包含居民區(qū)、工業(yè)區(qū)和農(nóng)業(yè)區(qū)，該支流取樣點處于下游且接收了污水處理廠排放的出水，賈瑞寶等[34]研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)行污水處理工藝對腎上腺皮質(zhì)激素類EDCs的去除能力有限，處理后出水的腎上腺皮質(zhì)激素類當量濃度依然較高，這些可能是導(dǎo)致該支流全年檢出腎上腺皮質(zhì)激素類活性且當量濃度較高的原因。荷蘭學(xué)者對地表水和污水出水中多種激素活性的研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，他們觀測到所測試的環(huán)境水樣中雄激素類、孕激素類和腎上腺皮質(zhì)激素類活性水平大多高于雌激素類水平[10]。

對比已報道的數(shù)據(jù)來看，4條檢出腎上腺皮質(zhì)激素類的小清河(濟南段)支流已經(jīng)受到了該類EDCs較大程度的污染，其含量水平高于已報道的飲用水中的腎上腺皮質(zhì)激素類濃度，小清河作為濟南市重要的城市內(nèi)部河流，其支流水環(huán)境中存在顯著水平的腎上腺皮質(zhì)激素類EDCs應(yīng)該引起重視。

3.4 雄激素類

Shi等[19]在中國東部長江、淮河和太湖流域的雄激素類含量水平篩查中，未發(fā)現(xiàn)雄激素類活性，本研究團隊運用CALUX法測試了濟南市4座水庫二噁英類、雌激素類、腎上腺皮質(zhì)激素類和雄激素類的含量水平，二噁英類當量濃度范圍為0.009～0.250 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，雌激素類當量濃度范圍0.040～0.250 ng E2-eq·L-1，未發(fā)現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)激素類和雄激素類活性[35]。河流水中雄激素活性的相關(guān)報道較少，由測試結(jié)果可得出小清河(濟南段)支流受雄激素類EDCs的污染水平較低。

城市河流作為重要的泄洪排污方式，其EDCs等新型污染物的污染也應(yīng)該引起相應(yīng)的重視。從調(diào)研結(jié)果看出，在為期1年的調(diào)研期內(nèi)，小清河(濟南段)主要支流均受到4類EDCs不同程度的污染，對比已報道的國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)，二噁英類和雌激素類的污染水平總體較低，受雄激素類EDCs的污染風(fēng)險較低，4類EDCs中腎上腺皮質(zhì)激素類的毒性當量對水環(huán)境污染貢獻最大。

未來研究中，將生物分析作為快速篩查手段，篩選污染物類型，再結(jié)合化學(xué)分析精準定位污染物，實現(xiàn)生物分析和化學(xué)分析的有效結(jié)合，為水環(huán)境污染物篩查和污染物去除研究提供數(shù)據(jù)支撐。

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