何春桃，嚴(yán)驍，付惠玲，莊僖，鄭晶,*，麥碧嫻，楊中藝，于云江

1. 中山大學(xué)農(nóng)學(xué)院，深圳 518107 2. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510530 3. 湖南工學(xué)院安全與環(huán)境工程學(xué)院，衡陽 421002 4. 中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640

磷酸三苯酯(triphenyl phosphate, TPhP)是在多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)限制使用后的重要替代阻燃劑，作為Deca-BDE的替代劑被廣泛應(yīng)用于電子產(chǎn)品中。環(huán)境調(diào)查指出TPhP廣泛存在于水體、空氣與室內(nèi)灰塵等環(huán)境介質(zhì)中[1-2]，在人發(fā)等生物樣品中也存在較高檢出[3]。TPhP具有神經(jīng)毒性[4]、發(fā)育毒性[5]等多種生物毒性，其中，TPhP的脂類代謝干擾作用受到廣泛關(guān)注。過去研究指出TPhP作為過氧化物酶增殖激動(dòng)劑受體γ(peroxisome proliferation active receptor gamma,PPARγ)的潛在配體，能激活PPAR信號(hào)通路，并改變脂類代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)水平[6]。已有研究報(bào)道TPhP暴露能夠引起前脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累效應(yīng)[7]。然而，TPhP經(jīng)microRNAs (miRNAs)對(duì)PPAR信號(hào)通路的調(diào)控作用目前仍為空白。

過去研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染會(huì)誘導(dǎo)人體白細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞和胃等不同組織中miRNA表達(dá)水平發(fā)生改變[8-10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)全氟辛烷磺?；衔锉┞赌軌蚴勾笫蟾闻K中調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的miR-451表達(dá)下調(diào)，調(diào)控細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)和促癌基因激活等通路的miRNAs表達(dá)上調(diào)。部分污染物的暴露會(huì)使影響生物中負(fù)責(zé)某一功能的多個(gè)miRNAs的表達(dá)改變，如四氯二苯并-p-二噁英(tetra-chloro-dibenzo-p-dioxins, TCDD)暴露下胎鼠胸腺細(xì)胞中負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡調(diào)控的多個(gè)miRNAs(如let-7e、miR-18b、miR-23a、miR-181c等)均表達(dá)下調(diào)，說明細(xì)胞凋亡是TCDD暴露下miRNA調(diào)控介導(dǎo)的主要毒性作用[12]。鑒于miRNA在環(huán)境壓力響應(yīng)過程中發(fā)揮的重要調(diào)控作用，miRNA作為環(huán)境污染物暴露的潛在生物標(biāo)志物的可行性日益受到關(guān)注[13]。然而針對(duì)環(huán)境污染物暴露對(duì)miRNAs表達(dá)調(diào)控作用的研究仍然比較匱乏。

肝臟是有機(jī)污染物解毒的重要場(chǎng)所，也是污染物暴露的毒害靶器官。因此，肝臟相對(duì)于其他器官對(duì)污染物的敏感性更高，對(duì)于污染物的肝臟毒性研究是污染物毒性評(píng)價(jià)的重要范疇。本研究將通過探討不同TPhP暴露條件下人肝細(xì)胞miRNAs表達(dá)的改變情況，明確人肝細(xì)胞對(duì)TPhP的應(yīng)答機(jī)制、篩選潛在的TPhP暴露風(fēng)險(xiǎn)生物標(biāo)志物。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

磷酸緩沖鹽溶液、1640基本培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶及抗生素(penicillin/streptomycin)均購自Gibco(Invitrogen，美國)，二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)購自Sigma-Aldrich (Poole，英國)。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、15 mL無菌離心管等細(xì)胞培養(yǎng)器皿購自康寧公司(中國)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司(中國)。試驗(yàn)溶劑均為HPLC級(jí)純，購自Sigma-Aldrich(Poole，英國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人肝正常細(xì)胞(HL-7702(L-02))購自武漢普諾賽生命科技有限公司(中國)。L-02細(xì)胞系是普通人肝上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的穩(wěn)定細(xì)胞系，相對(duì)于常用的肝癌細(xì)胞系，其細(xì)胞形態(tài)更接近于普通人肝上皮細(xì)胞，適用于對(duì)TPhP脅迫下人肝細(xì)胞miRNA響應(yīng)特征的研究。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中(37 ℃、5% CO2)。細(xì)胞以30%的密度接種后，次日進(jìn)行細(xì)胞染毒。替換細(xì)胞孔內(nèi)舊培養(yǎng)液為不同濃度TPhP(TPhP溶解于DMSO，總體積不超過培養(yǎng)基總體積0.5%)的新培養(yǎng)基。細(xì)胞活性檢測(cè)試驗(yàn)中，L-02細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞壁，處理時(shí)間為48 h，TPhP處理濃度為0.5、2、5、10和20 μg·mL-1，設(shè)置溶劑對(duì)照組(V(DMSO)∶V(培養(yǎng)基)=0.5∶100)、對(duì)照組(無處理)和空白(未接種細(xì)胞)，每個(gè)處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，細(xì)胞活性檢測(cè)重復(fù)2次。用于TPhP檢測(cè)和miRNA提取的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)置對(duì)照組(V(DMSO)∶V(培養(yǎng)基)=0.5∶100)、TPhP(5 μg·mL-1)暴露3 h和48 h，分別為CK、TPhP-3 h和TPhP-48 h，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

細(xì)胞活性采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(Donjido，日本)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照說明書進(jìn)行操作。孵育結(jié)束后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值。細(xì)胞活力的計(jì)算公式如下：

細(xì)胞活力=[(As-Ab]/(Ac-Ab)]×100%

式中：As為試驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8和有機(jī)污染物)的吸光值，Ac為溶劑對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8和DMSO)的吸光值，Ab為空白孔(不含細(xì)胞和毒性物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)的吸光值。

1.4 TPhP檢測(cè)

樣品提取與檢測(cè)參考Su等[14]的方法，培養(yǎng)結(jié)束后，收集培養(yǎng)基與細(xì)胞，分別加入1 mL甲醇于50 ng TPhP-d15內(nèi)標(biāo)至樣品中，對(duì)細(xì)胞樣品超聲提取30 min。轉(zhuǎn)移提取液至新的離心管中，樣品提取后用氮吹儀吹干，重新定容于300 μL甲醇后，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene, PTFE)膜過濾后待進(jìn)樣。

樣品定量采用三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(triple quadrupole LC/MS/MS mass spectrometer of API 4000+, AB Sciex Instruments)進(jìn)行分析，色譜系統(tǒng)采用Agilent 1260 G1311B-1進(jìn)樣泵與Agilent 1260 G1316A-1柱溫箱。以甲醇作為流動(dòng)相A，水作為流動(dòng)相B，以流速0.3 mL·min-1洗脫目標(biāo)化合物。質(zhì)量控制采用DMSO處理組作為對(duì)照組，設(shè)置溶劑組作為流程空白組，TPhP在對(duì)照組與空白組均低于檢出限。以TPhP-d15作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行回收率矯正。TPhP清除率檢測(cè)計(jì)算公式如下：

TPhP清除率=(cspiked-cremained)/cspiked

式中：cspiked為處理前TPhP的總量(μg)，而cremained為處理結(jié)束后培養(yǎng)基與樣品中TPhP的量(μg)。

1.5 miRNA測(cè)序與生物信息學(xué)分析

細(xì)胞RNA和miRNA的提取參照Allprep組織/細(xì)胞RNA/DNA/Protein/miRNA分提試劑盒(RN36，艾德萊，中國)說明書進(jìn)行。含miRNA的總RNA用Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent 2100 RNA 6000 Nano kit)檢測(cè)RNA樣品完整性與濃度后用于cDNA文庫構(gòu)建。cDNA文庫構(gòu)建用T4 RNA ligase先后在miRNA 3’端與5’端加上接頭。利用反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈。通過兩端的接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。在Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行單末端測(cè)序程序(SE50)，得到50 bp的單端測(cè)序reads。

測(cè)序獲得每個(gè)樣品的原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw reads)，按照測(cè)序質(zhì)量對(duì)這部分raw reads進(jìn)行過濾。去除低質(zhì)量(包括存在5’端接頭污染的、缺乏3’端接頭序列或包含polyA/T/G/C、沒有插入片段等情況)的reads。過濾后的數(shù)據(jù)為miRNA的tag序列。對(duì)miRNA的tag序列進(jìn)行注釋。鑒定樣品中的miRNA的tag序列組成，將tag序列比對(duì)到人類基因組、genebank、Rfam數(shù)據(jù)庫、外顯子的內(nèi)含子、重復(fù)序列和已知的miRNAs中，并在此基礎(chǔ)上對(duì)tag進(jìn)行分類注釋。按照優(yōu)先級(jí)rRNAetc > exist miRNA > exist miRNA edit > known miRNA > repeat > exon > novel miRna > intron的順序?qū)ag序列進(jìn)行分類，tag沒有比對(duì)上任何的注釋信息的標(biāo)記為unann，其中注釋為miRNA前體的miRNAs用mir命名，如mir-16。對(duì)各個(gè)樣品所鑒定的miRNAs計(jì)算TPM(tags per million)作為其表達(dá)量，最終獲得各樣品全部miRNAs的表達(dá)譜，并在此基礎(chǔ)上對(duì)miRNAs進(jìn)行表達(dá)差異進(jìn)析。樣品間miRNAs表達(dá)量變化2倍以上并且P值<0.05的差異表達(dá)miRNAs為差異顯著。采用Mireap (https://sourceforge.net/projects/mireap/)、Miranda(http://www.microrna.org/-microrna/home.do)和Targetscan(http://www.targetscan.org/)[15-16]3個(gè)軟件根據(jù)miRNAs序列信息對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，取三者預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為miRNAs靶基因預(yù)測(cè)的最終結(jié)果。對(duì)差異表達(dá)的miRNAs的靶基因進(jìn)行GO功能聚類分析和KEGG Pathway分析。對(duì)預(yù)測(cè)的miRNAs靶基因與轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)靶基因與差異表達(dá)基因的交集為差異表達(dá)miRNAs的潛在調(diào)控對(duì)象，進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)miRNAs與差異表達(dá)基因的表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，篩選獲得相關(guān)系數(shù)>0.9的miRNA-靶基因?qū)17]，使用Cytoscape software(http://www.cytoscape.org/)構(gòu)建miRNAs與差異表達(dá)基因的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 熒光定量PCR

cDNA合成及熒光定量PCR采用All-in-one miRNA qRTPCR detection Kit (GeneCopoeia，美國)，參照說明書操作。熒光定量PCR所涉及的基因與引物購自All-in-one miRNA qRTPCR detection Kit(GeneCopoeia，美國)。每個(gè)樣品每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，采用Roche LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，德國)及其配套軟件對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量，各目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量以目標(biāo)基因表達(dá)量/U6表達(dá)量表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0(SPSS, Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk非參數(shù)方法，不符合正態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)在計(jì)算前進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。單因素方差分析(One-way analysis of variance, ANOVA)用于比較不同處理濃度中細(xì)胞活性的差異。Pearson’s相關(guān)性檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與熒光定量PCR的基因表達(dá)情況進(jìn)行相關(guān)性分析，置信水平為P=0.05，置信區(qū)間取95%。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TPhP脅迫條件下細(xì)胞活性差異

在48 h處理?xiàng)l件下，TPhP染毒后，人肝細(xì)胞細(xì)胞活力隨著濃度上升呈先上升后下降的趨勢(shì)，在5 μg·mL-1處理?xiàng)l件下達(dá)到最大值，并在10 μg·mL-1處理濃度下明顯下降。而在20 μg·mL-1處理?xiàng)l件下，細(xì)胞活力受到顯著抑制(P<0.05)，僅為26.3%，半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)為15.25 μg·mL-1(46.7 μmol·L-1)(圖1)。

圖1 在48 h后不同濃度磷酸三苯酯(TPhP)處理組中人肝細(xì)胞的存活率曲線Fig. 1 Survival curves of hepatocyte after 48 h triphenyl phosphate (TPhP) treatments of different concentrations

2.2 TPhP脅迫3 h與48 h后TPhP含量分析

在5 μg·mL-1TPhP暴露3 h和48 h后，處理體系中人肝細(xì)胞與培養(yǎng)基中殘留的TPhP總量如圖2所示，培養(yǎng)基中的TPhP總量顯著高于細(xì)胞(P<0.05)。在肝細(xì)胞暴露3 h后，細(xì)胞中的TPhP總量為0.08 μg，培養(yǎng)基中TPhP總量為1.23 μg，培養(yǎng)體系中清除率為73.9%。肝細(xì)胞暴露48 h后，細(xì)胞中的TPhP含量顯著上升，而培養(yǎng)基中的TPhP含量顯著下降(P<0.05)。細(xì)胞中的TPhP總量為0.14 μg，培養(yǎng)基中TPhP總量為0.60 μg，培養(yǎng)體系中清除率為85.1%。

圖2 暴露3 h和48 h后不同TPhP處理組中細(xì)胞與培養(yǎng)基中TPhP的含量注：*代表相同處理下細(xì)胞與培養(yǎng)基中的TPhP含量差異顯著，小寫字母代表細(xì)胞或培養(yǎng)基中不同處理組的TPhP含量差異顯著。Fig. 2 The contents of residual TPhP in hepatocyte and medium after different TPhP treatment for 3 h and 48 hNote: *represents the significant difference between the TPhP contents in hepatocyte and medium under the same treatment while the different letters represent the significant difference between different treatments for hepatocyte or medium.

2.3 差異表達(dá)miRNAs的表達(dá)趨勢(shì)與富集

以定量PCR的方法檢測(cè)9個(gè)隨機(jī)選取的差異表達(dá)miRNAs的表達(dá)情況，以驗(yàn)證microRNA-Seq測(cè)序結(jié)果。相關(guān)性分析表明，同一樣品在microRNA-Seq與qPCR的表達(dá)情況顯著相關(guān)(r2=0.8068)(圖3)，說明microRNA-Seq的表達(dá)結(jié)果可靠。

圖3 microRNA-Seq與qPCR中miRNAs表達(dá)結(jié)果的相關(guān)性Fig. 3 The correlation between miRNAs genes’ expression assessed by microRNA-Seq and qPCR

為了初步分析不同樣品miRNAs表達(dá)的變化情況，對(duì)樣品中表達(dá)量TPM>1的差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行趨勢(shì)分析(圖4)，在CK、TPhP-3 h及TPhP-48 h這3個(gè)樣品中差異表達(dá)的miRNAs顯著富集于2個(gè)趨勢(shì)(profile 3和profile 5)。其中，富集于profile 3的差異表達(dá)miRNAs共有72個(gè)，表現(xiàn)為在3 h與對(duì)照組無顯著差異，在48 h暴露后表達(dá)顯著下降。富集于profile 5的差異表達(dá)miRNAs共118個(gè)，在3 h暴露后顯著上升，而在48 h暴露后與對(duì)照組無顯著差異。其他差異表達(dá)miRNAs的富集表達(dá)趨勢(shì)包括保持平緩后上升、上升后保持平緩、持續(xù)上升、下降后保持平緩及持續(xù)下降，富集均不顯著。

圖4 差異表達(dá)miRNAs在3個(gè)不同處理時(shí)間的主要富集趨勢(shì)Fig. 4 Differential expressed miRNAs significantly enriched in patterns across three time points

通過GO分析發(fā)現(xiàn)，profile 3中miRNAs所調(diào)控的靶基因主要分布于細(xì)胞內(nèi)部(intracellular part)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、細(xì)胞液(cytosol)和細(xì)胞器(organelle)中；所參與分子功能以結(jié)合活性為主包括離子結(jié)合(ion binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)及DNA結(jié)合(DNA binding)等，另外也具有酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)及轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)等催化功能；富集于profile 3的miRNAs調(diào)控的靶基因主要參與了生物合成(biosynthesis)、代謝過程(metabolic process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、刺激響應(yīng)(response to stimulus)、細(xì)胞分化(cell differentiation)等生物過程(圖5)。富集于profile 5中的miRNAs所調(diào)控的靶基因除了分布于profile 3中富集的細(xì)胞內(nèi)部(intracellular part、intracellular)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、細(xì)胞液(cytosol)及細(xì)胞器(organelle)幾種細(xì)胞組分，也顯著富集于細(xì)胞質(zhì)膜泡囊(cytoplasmic membrane-bounded vesicle)、高爾基體(Golgi apparatus)及細(xì)胞核(nucleus)等細(xì)胞組分，可能參與蛋白質(zhì)分泌等功能。所參與分子功能與profile 3中miRNAs的靶基因類似，包括離子結(jié)合(ion binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)等結(jié)合活性、酶調(diào)節(jié)活性(enzyme regulator activity)、分子功能調(diào)節(jié)(molecular function regulator)等調(diào)節(jié)功能及轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)、激酶活性(kinase activity)、連接酶活性(ligase activity)等催化功能；所參與生物進(jìn)程與profile 3類似，以生物合成(biosynthesis)、代謝過程(metabolic process)等生物進(jìn)程為主。

圖5 顯著富集于profile 3(P3)和profile 5(P5)的差異表達(dá)miRNAs的靶基因的GO富集顯著情況(P value)Fig. 5 The P value of significantly enriched GO term for target genes of miRNAs from profile 3 (P3) and profile 5 (P5)

Profile3與profile 5富集的miRNAs的靶基因顯著富集的通路相似，包括代謝通路、生物合成通路及癌癥相關(guān)的通路。生物合成通路包括類固醇合成(steroid biosynthesis)、萜類骨架生物合成(terpenoid backbone biosynthesis)、脂肪酸生物合成(fatty acid synthesis)等，其中類固醇的生物合成是profile 3所富集的miRNAs靶基因的主要富集通路。此外，脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(adipocytokine signaling pathway)、Jak-STAT信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路(insulin signaling pathway)及Hedgehog信號(hào)通路(Hedgehog signaling pathway)等信號(hào)通路也是富集于profile 3趨勢(shì)的miRNAs所調(diào)控的靶基因富集通路(表1)。

表1 Profile 3與profile 5差異表達(dá)miRNAs靶基因KEGG通路富集情況Table 1 Significantly enriched KEGG pathways for target genes of miRNAs from profile 3 and profile 5

2.4 脂類代謝相關(guān)的miRNA-mRNA關(guān)聯(lián)分析及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

miRNAs以抑制或降解等形式對(duì)靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控，對(duì)差異表達(dá)miRNAs與其關(guān)聯(lián)差異表達(dá)基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析能夠從miRNA水平上探索TPhP對(duì)miRNAs與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響。結(jié)合差異表達(dá)miRNAs的靶基因富集通路與差異表達(dá)基因富集通路分析可知[17]，TPhP脅迫條件下，類固醇合成等脂類代謝通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平改變受到miRNAs的調(diào)控作用。多個(gè)miRNAs通過調(diào)節(jié)脂類代謝相關(guān)的基因表達(dá)影響脂質(zhì)合成。胰島素信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、脂肪酸代謝、類固醇合成等與脂類代謝相關(guān)的差異表達(dá)顯著的關(guān)鍵基因受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控，miRNA-靶基因?qū)s160對(duì)。而miR-4484-y、miR-34c-5p、miR-301a-5p和miR-7-5p分別對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)通路中5個(gè)關(guān)鍵基因具有顯著的調(diào)控關(guān)系。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，PPAR信號(hào)通路中，PPARα與PPARγ這2個(gè)核受體、ACSL(long-chain acyl-CoA synthetase)、CYP27A1(cytochrome P450 family 27 subfamily A member 1)、HMGCS1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1)和SCD(stearoyl-CoA desaturase)等參與脂肪酸合成過程，類固醇合成通路中的CYP51A1(cytochrome P450 family 51 subfamily A member 1)、DHCR7(7-dehydrocholesterol reductase)、LSS(lanosterol synthase)和MSMO1(methylsterol monooxygenase)，以及胰島素信號(hào)通路中影響脂類平衡的ACACA(acetyl-CoA carboxylase/biotin carboxylase)、PRKAA2(5’-AMP-activated protein kinase)等基因均受到一個(gè)或多個(gè)miRNAs調(diào)控(圖6)。

圖6 脂類代謝相關(guān)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)注：綠色和藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)為miRNAs，粉色、橙色和紅色的節(jié)點(diǎn)分別為參與胰島素信號(hào)通路、類固醇合成通路及PPAR信號(hào)通路的靶基因。Fig. 6 The miRNA-RNA regulation network of lipid metabolismNote: The green and blue nodes represent the differential expressed miRNAs; the pink, orange and red nodes represent target genes involved in insulin signal pathway, steroid synthesis pathway and PPAR signal pathway respectively.

3 討論(Discussions)

從人肝細(xì)胞在不同濃度TPhP暴露下的細(xì)胞活性變化可知，低濃度TPhP脅迫不會(huì)引起人肝細(xì)胞的凋亡。在5 μg·mL-1的處理?xiàng)l件下，細(xì)胞活性存在輕微的上升，可能與PIK3CD(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit)參與的Jak-STAT signaling pathway信號(hào)通路所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與增殖過程的調(diào)控作用相關(guān)。中國倉鼠細(xì)胞在TPhP處理24 h后計(jì)算的50%最大抑制效應(yīng)濃度(50% of the maximal inhibitory effect concentration, IC50)為37 μmol·L-1[18]。Su等[14]對(duì)雞胚胎細(xì)胞開展的TPhP毒性研究中，雞胚胎肝細(xì)胞在TPhP處理36 h后，LC50為(47±8) μmol·L-1，與本研究中人肝細(xì)胞以TPhP染毒48 h后的LC50劑量基本一致，高于TPhP對(duì)中國倉鼠細(xì)胞的細(xì)胞毒性的IC50。這可能與2種肝細(xì)胞對(duì)于TPhP的代謝會(huì)降低其毒性有關(guān)。而高濃度TPhP存在明顯的急性細(xì)胞毒性，LC50基本在40 μmol·L-1左右，意味著對(duì)其開展環(huán)境監(jiān)測(cè)的必要性。

由3 h和48 h細(xì)胞內(nèi)殘留TPhP總量可知，人肝細(xì)胞對(duì)TPhP的代謝效率較高。TPhP在人肝細(xì)胞微粒中和S9的肝微粒組分中孵育1 h后，清除率分別為41%(其他磷系阻燃劑清除率為7%～81%)和19%(其他磷系阻燃劑清除率為13%～68%)[19]，相對(duì)于其他磷系阻燃劑，TPhP代謝速率處于中等水平，略高于磷酸三(2-氯乙基)酯和磷酸三(2-氯丙基)酯。雞胚胎肝細(xì)胞對(duì)TPhP暴露36 h后，TPhP清除率高達(dá)99.8%[14]，遠(yuǎn)高于本研究中48 h處理組的TPhP清除率，這種差異可能與細(xì)胞的不同物種來源有關(guān)。值得注意的是，TPhP在雞胚胎肝細(xì)胞的代謝特征顯示，在12 h暴露后細(xì)胞與培養(yǎng)基中的TPhP總量相當(dāng)(46%/53%)，在36 h處理后所有殘留的TPhP均存在于細(xì)胞中[14]。這與本研究中隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，TPhP在細(xì)胞中分配比例逐漸加大的趨勢(shì)相一致。由此我們推測(cè)在體外試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，細(xì)胞的TPhP吸收速率高于其代謝速率并引起細(xì)胞中的TPhP積累，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中的TPhP可能逐漸完全清除。

TPhP暴露條件下，差異表達(dá)的miRNAs靶基因主要富集于profile 3 (TPhP脅迫48 h后表達(dá)下降)和profile 5(在TPhP脅迫3 h表達(dá)上調(diào)，而在48 h后表達(dá)與對(duì)照組一致)。2個(gè)趨勢(shì)的靶基因主要富集于類固醇合成與脂類代謝有關(guān)的功能與通路，意味著脂質(zhì)代謝干擾是TPhP對(duì)miRNAs調(diào)控的主要毒性。而過去的研究指出斑馬魚在7 d的TPhP暴露后，其肝臟脂類代謝基因表達(dá)異常，血液中葡萄糖、甘油三酯、膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)顯著上升[20]。TPhP對(duì)斑馬魚胚胎的脂類代謝干擾作用通過對(duì)PPAR信號(hào)通路途徑的調(diào)控實(shí)現(xiàn)[21]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞BMS2細(xì)胞系在在10 μmol·L-1的TPhP暴露7 d后，脂質(zhì)積累顯著增加，并可能是潛在的PPARγ激活劑[6]。雖然過去研究在體外試驗(yàn)與動(dòng)物試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)了TPhP的脂類代謝干擾作用，但是這個(gè)過程中是否存在miRNAs的參與及其所扮演的角色尚不明確。過去的研究已鑒定了多個(gè)與脂類代謝相關(guān)的miRNAs[22-23]，而本研究也發(fā)現(xiàn)多個(gè)已報(bào)道脂類代謝相關(guān)的miRNAs，如miR-34c、miR-301a和miR-7。作為介導(dǎo)TPhP脂類代謝干擾的主要靶位點(diǎn)，PPAR主要受miR-34c調(diào)控，與本研究中miR-34c差異表達(dá)對(duì)PPAR信號(hào)通路中ACSL和DHCR7的表達(dá)調(diào)控作用相似，與過去文獻(xiàn)報(bào)道中miR-34c能夠通過調(diào)控ACSL1的表達(dá)水平參與小鼠的肝臟纖維化相一致[24]。而miR-301a對(duì)胰島素信號(hào)通路中ACACA及PRKAA2這2個(gè)基因具有調(diào)控作用則與miR-301a在糖尿病及胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程具有調(diào)控作用的調(diào)控功能相類似[25-26]。miR-7對(duì)神經(jīng)質(zhì)瘤、乳腺癌及肝癌的發(fā)生有著重要作用，F(xiàn)ang等[27]通過篩選發(fā)現(xiàn)，PIK3CD是miR-7的調(diào)控靶基因，miR-7的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致PIK3CD表達(dá)顯著下調(diào)，而且影響PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究中miR-7對(duì)PIK3CD的表達(dá)同樣具有顯著負(fù)調(diào)控關(guān)系，而PIK3CD所參與的胰島素信號(hào)通路能對(duì)下游脂肪酸合成過程中數(shù)個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平具有調(diào)控作用，從而對(duì)脂類平衡產(chǎn)生影響。與上述3個(gè)脂類代謝相關(guān)的miRNAs不同，針對(duì)miR-4484脂類代謝調(diào)控作用的研究并不多。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)乳腺導(dǎo)管乳腺癌與乳腺管內(nèi)頭狀瘤病人分泌乳汁中的miR-4484的表達(dá)水平存在顯著差異，miR-4484可作為潛在的乳腺癌指示物。Byun等[29]發(fā)現(xiàn)，miR-4484對(duì)于口腔炎癥反應(yīng)具有重要調(diào)控作用，并且是口腔扁平苔蘚疾病的潛在miRNAs生物標(biāo)志。受結(jié)核桿菌H37Ra株系感染的巨噬細(xì)胞THP-1中，miR-4484的表達(dá)相對(duì)于未感染細(xì)胞顯著上調(diào)約20倍，對(duì)于預(yù)測(cè)結(jié)核桿菌感染情況具有重要參考意義[30]。然而本研究中miR-4484對(duì)ACACA、ACSL和SCD等參與了脂肪酸/類固醇合成代謝通路基因的調(diào)控作用是首次報(bào)道。除了已知miRNAs，本研究鑒定的novel-m0022-5p等新miRNAs對(duì)類固醇合成通路中的LSS、PPAR信號(hào)通路中的PPARγ和CYP27A1具有調(diào)控作用，novel-m0323-5p則對(duì)胰島素信號(hào)通路中的ACACA、PPAR信號(hào)通路中的ACSL4及類固醇合成通路中的MSMO均有調(diào)控作用。但是在此前的研究尚未對(duì)這些新miRNAs功能開展研究，其具體調(diào)控機(jī)理仍待探討。

本研究通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)的脂類代謝相關(guān)的miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系與過去的研究有所差別。miR-122被認(rèn)為是肝臟中表達(dá)豐度最高的miRNAs，其表達(dá)能夠調(diào)控肝臟FASN(fatty acid synthase)、ACACA及SCD等一系列脂肪酸合成酶的基因表達(dá)[31]。但是在本研究中，miR-122表達(dá)水平偏低，并且與FASN、SCD等基因的表達(dá)水平無顯著相關(guān)。與miR-122的情況類似，miR-378/378*能夠通過調(diào)控FABP-4(fatty acid-binding protein)、FASN和SCD-1等脂質(zhì)代謝相關(guān)基因影響脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)積累[32]，然而在本研究中miR-378在不同處理間差異表達(dá)并不顯著。過去針對(duì)脂類代謝調(diào)控的miRNAs主要關(guān)注人體在自然條件下高膽固醇疾病的情況對(duì)miRNAs及脂類代謝的影響，與本研究中TPhP暴露所引起的脂類代謝干擾有所差異。稀有鮈鯽肝臟在TPhP暴露14 d后參與類固醇合成的HGMCoA與FASN酶活顯著高于對(duì)照組并引起膽固醇的積累，然而其差異誘導(dǎo)的miRNAs靶基因主要富集于代謝通路[33]，與本研究中差異表達(dá)miRNAs主要富集于PPAR信號(hào)及其下游脂類代謝通路的情況并不一致。我們推測(cè)，本研究所發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miRNAs可能特異性地在早期脅迫下通過調(diào)控PPAR信號(hào)通路，加強(qiáng)類固醇合成相關(guān)通路基因的表達(dá)，并在長(zhǎng)期脅迫中表達(dá)恢復(fù)正常表達(dá)水平，預(yù)示著miR-4484和novel-m0022-5p等miRNAs作為潛在的生物標(biāo)記對(duì)于TPhP早期暴露指示具有可行性。

miRNAs在疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，同時(shí)也是多種疾病的潛在生物標(biāo)記物[34]。隨著miRNAs在環(huán)境污染物暴露過程中所發(fā)揮的調(diào)控作用的深入，miRNAs作為環(huán)境污染物暴露生物指示物的可行性受到關(guān)注[35]。本研究發(fā)現(xiàn)在TPhP暴露條件下，人肝細(xì)胞miR-4484、miR-3617和miR-7等miRNAs受TPhP誘導(dǎo)差異表達(dá)，并調(diào)控多個(gè)參與脂類代謝過程的目標(biāo)基因，預(yù)示著這些miRNAs是TPhP暴露條件下潛在的敏感生物標(biāo)記。然而，在生物體中，miRNAs的表達(dá)除了受到環(huán)境污染物的影響，還受到生物體年齡、生活習(xí)慣和身體健康情況等多個(gè)因素的影響，miRNAs直接作為人群對(duì)環(huán)境污染物暴露健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的生物指示物準(zhǔn)確度有待提高。因此，通過進(jìn)一步系統(tǒng)研究，上述對(duì)TPhP暴露誘導(dǎo)的脂類代謝具有調(diào)控作用的差異表達(dá)miRNAs將有可能應(yīng)用于環(huán)境中污染物典型的潛在生物標(biāo)志物，為指示環(huán)境污染對(duì)生物體健康情況的影響提供參考。

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