夏珍珍 彭茂民 鄭 丹 夏 虹 周有祥 彭立軍 王 清

（1.湖北省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)農村部農產品質量安全風險評估實驗室（武漢），湖北省農產品營養(yǎng)品質與安全重點實驗室，武漢 430064；2.丹江口市農業(yè)環(huán)境保護站，湖北丹江口 442700）

茶葉是在全球范圍內廣泛飲用的飲品之一，茶葉及其飲用方式帶來的養(yǎng)生價值受到人們普遍關注。湖北是“茶祖”神農、“茶圣”陸羽的故鄉(xiāng)，產茶歷史悠久，且擁有良好的氣候資源優(yōu)勢，屬于中國茶葉四大產區(qū)之一的江南產區(qū)[1～2]。目前，在湖北省內形成了4個優(yōu)勢產區(qū)，即鄂東北大別山產區(qū)、鄂西南武陵山產區(qū)、鄂西北秦巴山產區(qū)和鄂南幕阜山邊銷茶產區(qū)，且逐漸形成了涵蓋綠茶、紅茶、磚茶等的名優(yōu)茶品[3～4]。湖北的茶葉產區(qū)主要分布在山區(qū)，是湖北山區(qū)縣級發(fā)展的支柱產業(yè)，也是山區(qū)解決勞動力和鄉(xiāng)村振興的重要產業(yè)方向。茶葉是多年生木本植物，田間生長周期長，在種植階段容易受到產地環(huán)境污染的影響，如環(huán)境水、土壤、空氣中的重金屬、有機污染物、毒素等有害物質會通過葉片和根系的作用吸收進入茶葉葉片，從而對最終的茶葉產品造成污染[5]。

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是一類由紫草科、菊科、豆科等植物產生的天然毒素，用于防御和抵抗昆蟲和食草動物對其的侵害[6]。PAs具有的特殊結構對動物和人類有一定的毒性，侵害的毒性主要通過攝入含有PAs毒性的中草藥和受PAs污染的食物，包括蜂蜜、肉類、谷物、茶葉等[7～8]。攝入人體內的PAs大部分通過腎臟和尿道排除，但是仍然有部分PAs會通過肝臟轉化從而跟體內的DNA和蛋白質結合導致肝毒性和遺傳毒性[9～10]。因此，關注暴露和不知情攝入PAs的情況具有重要的意義。

有研究表明，雖然茶葉本身并不屬于產生PAs的植物，但是茶園中的雜草中往往含有PAs，且會通過根系的作用從而污染茶葉葉片[11]。近年來，德國聯(lián)邦風險評估研究所發(fā)現德國市場上的部分茶葉中檢出PAs類生物堿，且部分樣品中含量高，雖然短期飲用不會造成急性健康風險，但是長期的暴露則會存在健康風險[12]。目前，對于我國茶葉中PAs的暴露水平及其健康風險方向的研究較少，因而需要對我國茶葉中PAs的污染水平進行調研分析?；诖?，選取湖北省主要的茶葉主產區(qū)，采集不同季節(jié)和不同種類的干制茶樣品，采用超高效液相色譜串聯(lián)質譜法（UPLC－MS/MS）分析干制茶樣品中PAs含量水平，比較不同產地、不同茶葉種類、不同季節(jié)的茶葉中PAs含量間的差異變化，描繪湖北省茶葉中PAs的污染特征。另外，結合主產茶區(qū)茶園雜草的調研取樣分析，確定茶葉中PAs的可能污染來源和主要單一種類。最后，通過專門的健康風險評估模型對其健康風險進行評估，為湖北省茶葉的PAs風險監(jiān)測提供支撐數據，為未來制定相應的管控措施提供理論參考。

一、樣品采集及制備

（一）茶葉樣品的采集及制備選取湖北省5個茶葉產區(qū)開展茶葉（紅茶、綠茶和磚茶）中PAs的排查，共采集茶葉樣品89份，其中宜昌地區(qū)茶葉樣品49份（紅茶樣品41份、綠茶樣品8份）；恩施地區(qū)茶葉樣品10份（綠茶樣品5份、紅茶樣品5份）；咸寧磚茶樣品10份；英山綠茶樣品10份；大悟綠茶樣品10份。這批茶葉樣品又可依據采摘的季節(jié)不同將其細分為春、夏、秋茶3類。采集的干制茶通過高速中藥磨粉機進行粉碎，過100目篩，后裝入自封袋4℃避光保存，以待檢測。

（二）雜草樣品的采集及制備選取茶園3處，采集茶園中主要雜草樣品，去除雜草根部和黃葉子，保留其他部分，切碎后用打碎機打成雜草漿，－18℃冷凍保存。

二、分析方法

（一）試劑與儀器共選擇了15種PAs，包括天芥菜堿（heliotrine，He）、天芥菜堿－N－氧化物（heliotrine－N－oxide，HeNO）、促黑激素（intermedine，Im）、促黑激素－N－氧化物（intermedine－N－oxide，ImNO）、千里光堿（jacobine，Jb）、千里光堿－N－氧化物（jacobine－N－oxide，JbNO）、倒千里光堿（retrorsine，Re）、倒千里光堿－N－氧化物（retrorsine－N－oxide，ReNO）、千里光寧堿（senecionine，Sc）、千里光寧堿－N－氧化物（senecionine－N－oxide，ScNO）、千里光菲靈堿（seneciphylline，Sp）、千里光菲靈堿－N－氧化物（seneciphylline－N－oxide，SpNO）、克氏千里光堿（senkirkin，Sk）、歐天芥菜堿（europine，Eu）、歐天芥菜堿N－氧化物（europine N－oxide，EuNO）。標物由中國農業(yè)科學院茶葉研究所提供，用乙腈（色譜純，國藥集團）配置成10 mg/L的儲備液，4℃避光保存。濃硫酸（分析純，國藥集團）、甲酸（色譜純，國藥集團）、氨水（色譜純，國藥集團）、甲酸銨（優(yōu)級純，阿拉丁試劑公司）、PCX固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國安捷倫公司）、0.22μm水系針式過濾頭（天津市津騰實驗設備有限公司）。

UPLC－MS/MS，包括LC－30AD液相色譜儀（日本Shimadzu公司）和Qtrap 4500串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）。數據采集通過Analyst工作站，數據處理為MultiQuant分析軟件。ME－2002E 102型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器公司）、MS 3型渦旋儀（德國IKA公司）、TDL－5C臺式大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）、Milli－Q超純水處理儀（美國Millipore公司）、高速中藥磨粉機（濟南達微機械有限公司）。

（二）前處理方法PAs的分析方法參考文獻[13～14]，取1.00 g茶葉粉末或雜草漿于50 mL離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L硫酸，渦旋2 min，靜置過夜（或超聲15 min）提取，經10 000 r/min離心10 min，上清液轉移到50 mL離心管中；殘渣再加入10 mL 0.1 mol/L硫酸，超聲15 min，經10 000 r/min離心10 min；將上述2次制備的上清液合并，取10 mL，待固相萃 ?。╯olid phase extraction，SPE）凈化。分別采用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化PCX SPE柱，再將上述待凈化的10 mL上清液分2次加入PCX SPE柱；待上清液的液面與SPE上層齊平時，分別采用5 mL去離子水（含1%甲酸）與5 mL甲醇進行淋洗，再采用5 mL甲醇（含0.5%氨水）洗脫；洗脫液經0.22μm濾膜于UPLC－MS/MS自動進樣瓶，待UPLC－MS/MS分析。

（三）儀器方法色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8μm），流動相A為1 mmol/L甲酸銨甲醇溶液（含0.1%甲酸），流動相B為1 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），洗脫梯度見表1。流速為0.25 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為2μL。正離子電噴霧電離（ESI+），多反應監(jiān)測模式（MRM），MRM參數見表2。工作曲線的濃度范圍為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L，外標法定量，采用同種類茶葉或同一科屬雜草配制基質標準溶液進行定量。

（四）數據分析分析茶葉中PAs的總量水平（最高值、最低值、中值、平均值和95%分位值），確定總體污染狀況，通過分析單一PAs檢出率和含量水平，確定主要污染成分。按不同茶類、不同產地和不同季節(jié)分析PAs總量和單一種類PAs的污染差異，比較茶葉中PAs污染水平和茶園中雜草PAs種類和含量相關性，分析茶葉中PAs的可能的雜草來源。通過Excel 2010進行數據分析，Origin Pro 9.0繪制圖表。

三、結果與分析

（一）茶葉中PAs檢出基本情況

1.茶葉中PAs的檢出率、檢出種類和濃度分布范圍。分析89份茶葉樣品PAs的檢出率和檢出種類情況，發(fā)現89份茶葉樣品中，18份茶葉樣品中檢出PAs，湖北省茶葉樣品中PAs的整體檢出率為20.2%。其中檢出的濃度范圍在1.15～34.45 μg/kg，中 位 值4.02μg/kg，平 均 值7.78μg/kg，95%分 位 值 為27.47μg/kg。KALTNER等[13]和SCHULZ等[15]分析了德國市售的品牌花草茶，發(fā)現茶葉 中 的PAs的 含 量 范 圍 在0.3～253.4μg/kg。MATHON等[16]的研究表明瑞士品牌花草茶中PAs的含量在0.02～1.90μg/L。PICRON等[17]的研究表明比利時的茶葉中PAs含量范圍在43～113μg/kg。茶葉中的PAs污染問題已經受到全球國家的關注，對比發(fā)現，湖北茶葉中PAs的含量分布整體較低，德國和比利時茶葉中PAs污染水平較高，這也可能是因為湖北的茶葉種類主要是紅茶、綠茶和磚茶為主，德國和比利時的茶葉以花草茶為主。

分析單一PAs的檢出情況可知，15種PAs中陽性檢出的包括Jb、JbNO、EuNO、ReNO、Sp和Sk 6種，He、HeNO、Im、ImNO、Eu、Re、Sc、ScNO和SpNO共計9種未檢出。單一PAs的含量水平（最高值、最低值、中值和95%分位值）等統(tǒng) 計 信 息 見 表3。其 中，Jb、JbNO、EuNO、ReNO、Sp和Sk單一PAs檢出率分別為1.1%、6.7%、2.2%、5.6%、2.2%和2.2%。比較發(fā)現，JbNO的檢出率最高，ReNO檢出率次之，EuNO、Sp和Sk檢出率相當，位列第三，Jb的檢出率最低。6種單一PAs中，EuNO的平均含量最高，為16.53μg/kg。

表3 湖北茶葉中單一PAs統(tǒng)計情況

2.不同地區(qū)茶葉的檢出情況。分析湖北省5個茶葉產區(qū)（宜昌、恩施、咸寧、英山、大悟）茶葉樣品中PAs的檢出率情況得出，5個產區(qū)中僅宜昌、咸寧、大悟3個產區(qū)有檢出，檢出率分別為30.6%、20.0%和10.0%，宜昌地區(qū)茶葉中PAs檢出高出湖北省平均水平，恩施和英山的茶葉未檢出PAs。檢出產區(qū)的PAs分布情況見圖1。其中，宜昌地區(qū)的茶葉檢出PAs種類有7種，種類和頻次分別為Jb檢出2次、JbNO檢出6次、EuNO檢出1次、ReNO檢出7次、ScNO檢出6次、Sp檢出2次、Sk檢出7次。大悟地區(qū)的茶葉僅檢出EuNO，檢出1次。咸寧地區(qū)檢出3種PAs，種類和頻次分別為Sc檢出1次、ScNO檢出1次、Sk檢出6次。

圖1 不同產區(qū)茶葉中PAs分布情況

3.不同茶葉種類的檢出情況。分析湖北省紅茶、綠茶和磚茶3類茶葉中的PAs情況發(fā)現，紅茶的檢出率為28.3%；磚茶的檢出率為20.0%；綠茶的檢出率為9.1%。與全省茶葉的整體情況相比，紅茶的PAs的檢出率高于全省茶葉的平均水平；磚茶與全省PAs的檢出水平相比，略低；綠茶的PAs檢出率要遠低于全省茶葉的PAs的檢出率。不同種類茶葉PAs分布見圖2。有研究表明，不同茶類的茶葉中[13]，博士茶中PAs污染最為嚴重，其次是花草茶和紅茶，博士茶是一種草本茶類，易受茶園中雜草的污染。本文發(fā)現紅茶中PAs的污染率較綠茶和磚茶高，也與文獻中的發(fā)現較為一致。因而，按茶種類分，PAs的污染情況依次為博士茶>花草茶>紅茶>綠茶>磚茶。

圖2 不同產區(qū)茶葉中PAs分布情況

分析各類茶葉中PAs的檢出種類和頻次情況發(fā)現，紅茶中檢出Jb 1次、JbNO 5次、EuNO 1次、ReNO 5次、ScNO 6次、Sp 2次、Sk 7次，共計7種。綠茶中檢出PAs共計4種，其中Jb、Jb-NO和EuNO檢出頻次各1次，ReNO檢出2次。磚茶檢出3種PAs，種類和頻次分別為Sc 1次、ScNO 1次、Sk 6次。

4.不同季節(jié)茶葉的檢出情況。從茶葉采摘的季節(jié)角度分析，發(fā)現春茶中PAs的檢出率為16.7%；夏茶中PAs的檢出率為30.4%；秋茶中PAs的檢出率為12.5%。其中，夏茶的檢出率水平要高于湖北省的平均水平，春茶和秋茶的檢出率要遠低于平均水平。按茶葉種類分，檢出的PAs的含量分布情況見圖3。

圖3 不同季節(jié)茶葉中PAs分布情況

分析各季茶葉中PAs的檢出種類和頻次情況發(fā)現，春茶中檢出JbNO 3次、EuNO 1次、ReNO 3次、ScNO 4次、Sp 1次、Sk 4次，共計6種。夏茶中檢Jb 2次、JbNO 2次、ReNO 4次、ScNO 2次、Sp 1次、Sk 3次，共計6種。秋茶中檢出JbNO和EuNO各1次。

（二）茶園雜草中PAs檢出基本情況實地調查茶園中雜草情況，采集雜草樣品24份，共涉及雜草種類18種。通過對茶園雜草的PAs分析，雜草中PAs的檢出率為79.2%，平均值為3.871×103μg/kg，含量范圍為1.86～2.67×104μg/kg?？疾靻我籔As的檢出率，雜草中檢出的PAs共有12種，分別的檢出率分布見圖4。位于前三位的為JbNO、ReNO和ImNO，檢出率分別為58.3%、54.2%和25.0%，檢出平均值分別為1.72×103、2.65×103、1.56×103μg/kg，其他PAs的含量分布見表4。

表4 湖北茶園雜草中PAs統(tǒng)計情況

圖4 湖北茶園雜草中單一PAs檢出率分布

通過分析雜草種類，野葵花、烏蘞莓、藿香薊、野茼蒿、竹葉草、鵝腸草、狗尾草、牛膝菊、辣蓼、美洲商陸、牛筋草、馬唐、鴨跖草、夏堇、魚腥草、牛筋草這幾種雜草中都不同程度地檢出PAs。其中野茼蒿、烏蘞莓中的JbNO和ReNO二者含量較高；藿香薊、鴨跖草、鵝腸草中的ImNO含量較高。對比分析茶葉中PAs含量和雜草中PAs含量平均值，茶葉中PAs含量約為雜草中PAs含量的1‰左右，雜草中檢出率前兩位的PAs為JbNO、ReNO，與茶葉中檢出率前兩位的PAs種類一致。因而，雜草可能是茶葉的PAs的潛在來源之一。

（三）茶葉中PAs風險評估由于PAs具有一定的肝毒性、肺毒性、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性、致突性[18]，國際食品法典委員會（CAC）和歐盟均采用了暴露邊際（margin of exposure，MOE）法對其進行評估[19]。MOE的評估方法為：MOE=BMDL10/EDI，其中BMDL10為10%作用基準劑量置信下限；EDI為茶葉中PAs的每日攝入量（estimated daily intake，EDI），茶葉膳食量以10.46 g計，該茶葉膳食量為2013年國家食品安全風險評估中心通過非連續(xù)的“3天24小時”回顧方法，對我國9?。ㄊ校ū本┦小⒑邶埥?、上海市、江西省、山東省、湖北省、廣東省、貴州省、甘肅省）居民茶葉消費狀況調查得出的結果。體重以60.6 kg計[20]，PAs含量以單一PAs的總和計，含量取值95%分位點，即EDI＝95%分位點值×。當MOE>10 000時，健康風險較低。目前歐盟和CAC分別制定了70μg/（kg bw·d）和237μg/（kg bw·d）的10%作用基準劑量置信下限（BMDL10）[21]，根據歐盟和CAC的BMDL10值來計算不同產區(qū)、不同季節(jié)和不同茶類的MOE風險結果見表5。從結果看，分別從整體、地區(qū)、季節(jié)和種類來評價，湖北省茶葉中的PAs健康風險較低。

表5 湖北茶葉中PAs風險評估結果

四、結論

本文采用采用UPLC－MS/MS分析了湖北省地區(qū)的茶葉中PAs污染情況，并通過MOE方法評價了其健康風險。結果表明，雜草和茶葉中PAs的檢出率分別為79.2%和20.2%，PAs的總含量范圍分別為1.86～2.67×104μg/kg和1.15～34.45μg/kg。比較茶葉種類發(fā)現，紅茶中PAs的檢出率最高，磚茶次之，綠茶最低；比較5個茶葉主產區(qū)的PAs檢出率，PAs的檢出率依次為宜昌、咸寧、大悟（恩施、英山地區(qū)的茶葉未檢出PAs）；比較不同季節(jié)，依次為夏茶的檢出率最高，春茶次之，秋茶最低。根據MOE結果判斷，無論從產區(qū)、季節(jié)和種類角度評價，湖北省茶葉的PAs健康風險較低。通過茶園中雜草種類和PAs分析，發(fā)現雜草是茶葉中PAs的可能來源之一，但是其遷移途徑和轉化規(guī)律有待下一步研究。