張若愚，李雪寧，林冰潔，王秀云，翟慶峰

(1.濰坊醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，山東 濰坊 261053； 2.濰坊市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，山東 濰坊 261000；3.坊子仁康醫(yī)院內科，山東 濰坊 261200)

納米二氧化鈦(titanium dioxide nano particles，TiO2-NPs)是一種粒徑在1～100 nm內的棒狀納米材料，具有較強的表面活性[1]。其粒徑越小，比表面積越大，生物活性越強。然而這個作用是雙向的，一方面它對癌癥細胞及原核細胞生物具有較強的殺傷作用，并借此發(fā)揮抗癌殺菌效果[2-3]，另一方面它也會對正常細胞產(chǎn)生潛在的殺傷作用[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs具有高效的殺菌、抑菌、抗癌、藥物傳遞能力，以及構建人體再生組織等生物活性與功能，因此其作為一種新興材料備受關注[5-9]。但TiO2-NPs等納米材料也具有潛在的環(huán)境危害與生物毒性，其較小的粒徑可以以單獨形式或配合物等形式存在于環(huán)境中，并穿過多種生物屏障最終進入人體組織，持續(xù)蓄積，對心臟、肝臟、大腦等重要器官產(chǎn)生損害[10]。未來TiO2-NPs極有可能被廣泛應用于人類衣食住行等各方面，在人工以及天然環(huán)境下大量存在，因此對其毒性的研究顯得尤為重要?，F(xiàn)就TiO2-NPs的蓄積作用與生物毒性研究進展予以綜述，進而更辨證地了解TiO2-NPs的廣泛應用產(chǎn)生的影響。

1 生物蓄積

大部分TiO2-NPs具有粒徑小，表面涂層活性高的特點，環(huán)境中的TiO2-NPs能夠從植物根部吸收，并轉運至莖與葉中，從而進入生態(tài)環(huán)境，影響土壤中微生物菌群分布，干擾氮循環(huán)[11-12]。同時環(huán)境中的TiO2-NPs又能隨食物鏈進入生物體并在體內發(fā)生蓄積，影響機體健康，甚至通過改變體內遺傳物質，影響生物多態(tài)性[13]。通常，TiO2-NPs不單一出現(xiàn)在環(huán)境中，而是以與有害物質相結合的方式協(xié)同暴露并發(fā)生生物蓄積。近年的研究重點關注了TiO2-NPs與重金屬、農(nóng)藥等協(xié)同暴露帶來的影響。研究發(fā)現(xiàn)，由于TiO2-NPs具有較高的生物利用度，因此它容易成為重金屬的有效載體，可與其構成配合物并長期存在于環(huán)境中[14]。當這些配合物通過食物鏈直達生物體內時就會產(chǎn)生生物富集，并最終進入人體，在體內不斷蓄積，提高機體內活性氧類(reactive oxygen species，ROS)等氧化活性物質的含量，對脂質含量較高的腦組織等造成損害，進而造成神經(jīng)退行性損傷，最終影響機體健康[13-15]。除重金屬外，TiO2-NPs還常與農(nóng)藥配合使用，作為農(nóng)藥載體或降解劑參與農(nóng)藥制備或后處理，從而廣泛蓄積于水、土壤、空氣等環(huán)境中，對生物健康造成潛在損害[16]。

在不同暴露途徑下，納米材料的毒性有顯著差異，傳統(tǒng)研究中，暴露途徑包括口鼻吸入、經(jīng)口灌胃、靜脈血管注射等方式[17-18]?；诳诒潜┞兜难芯堪l(fā)現(xiàn)，納米金屬粒子等長時間暴露將在機體內發(fā)生不可逆的蓄積并造成損傷，在心血管系統(tǒng)中，這一現(xiàn)象更為明顯，它能夠誘導并加劇心律失常甚至心力衰竭的發(fā)生[19]。這可能與長時間的暴露使得納米金屬粒子在機體內無法在短時間內完全清除，使得這些物質逐漸在體內蓄積，反復刺激機體產(chǎn)生氧化自由基，影響體內激素水平、脂質代謝有關[20]。但在短期暴露的研究發(fā)現(xiàn)，TiO2-NPs通過消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及血液循環(huán)系統(tǒng)等實現(xiàn)完全代謝[21]。而經(jīng)口灌胃的暴露研究則關注了TiO2-NPs在人體內蓄積對腸道菌群的影響。有學者對比了正常小鼠與TiO2-NPs顆粒暴露小鼠的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs暴露后小鼠的腸道菌群豐富度和均勻度降低，小鼠腸道微生物群落組成受到嚴重干擾[22]。不僅如此，還有研究發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs暴露的小鼠非器質性運動能力減退，這一神經(jīng)行為的改變可能與TiO2-NPs暴露導致的腸道菌群改變影響了腸道-腦軸的中樞間雙向通訊有關[23]。但一項關于食品級TiO2-NPs通過經(jīng)口暴露的研究認為，TiO2-NPs對人體腸道菌群沒有顯著改變，可能提示TiO2-NPs的腸道代謝較呼吸系統(tǒng)代謝更為完全，不易產(chǎn)生蓄積，可以安全地應用于食品生產(chǎn)與加工[24]，但結果仍需進一步研究驗證。

2 生物毒性

2.1神經(jīng)毒性 由于大部分TiO2-NPs粒徑較小、透過性較高，因此粒徑為8～35 nm的TiO2-NPs能夠通過血腦屏障，影響大腦皮質的神經(jīng)反射活動[25-26]。而通過血腦屏障的TiO2-NPs會留存于腦組織中，導致包括丙二醛、一氧化氮、腫瘤壞死因子-α等在內的多種生物標志物水平上升，嚴重者還會引發(fā)神經(jīng)元的凋亡壞死，造成腦組織變性死亡等病理學變化[27]。一項關于TiO2-NPs的暴露實驗檢測了斑馬魚多種神經(jīng)組織內的生物標志物水平，如去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺等，結果發(fā)現(xiàn)水平均降低，說明TiO2-NPs長期暴露會嚴重干擾生物的神經(jīng)活動，影響大腦皮質功能[28]。然而，不僅局限于上層神經(jīng)網(wǎng)絡，對神經(jīng)遞質的研究也發(fā)現(xiàn)，TiO2-NPs的暴露還會降低乙酰膽堿酯酶的水平及活性，干擾神經(jīng)遞質的傳遞，阻礙正常的信號轉導[10,29]。

值得注意的是，以上這些影響并不局限于成年個體。研究發(fā)現(xiàn)，TiO2-NPs的母體暴露可以通過胎盤屏障及子代血腦屏障，過度激活胞外信號調節(jié)激酶/促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，引發(fā)小鼠后代軸突和樹突生長遲緩，對子代神經(jīng)發(fā)育造成損傷[30]。對裸鼠大腦皮質的研究發(fā)現(xiàn)，隨著TiO2-NPs劑量的增高，神經(jīng)元凋亡和腦組織變性的現(xiàn)象會顯著增加，最終將導致大腦的退行性損傷和變化，這可能是TiO2-NPs暴露導致后代小鼠學習能力下降的主要機制[27,31]。此外，也有學者認為母代大鼠哺乳期TiO2-NPs暴露導致后代學習和記憶能力顯著下降的原因為TiO2-NPs誘導動物海馬組織內釋放c-Jun氨基端激酶，降低了海馬體中的谷氨酰胺和谷氨酰胺合成酶水平，導致海馬組織堿性磷酸化、甲基化等損傷，進而造成大腦皮質負責學習行為的部分組織損傷[32-33]。

目前研究證實，無論是孕期、哺乳期，還是成年期，人類各個階段的TiO2-NPs暴露均會導致機體內各類生長因子水平異常，多巴胺能神經(jīng)元消失，影響機體內神經(jīng)系統(tǒng)，對機體及其子代產(chǎn)生學習記憶等方面的不良影響，還可能導致帕金森病等神經(jīng)退行性疾病[34]。

2.2生殖毒性及發(fā)育毒性 有研究表明，TiO2-NPs暴露可通過干擾正常內分泌軸，引起激素分泌水平紊亂，導致各項生理活動異常，對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。然而，在不同性別中，其產(chǎn)生的生殖毒性卻不盡相同，見表1。

表1 TiO2-NPs的生殖毒性與發(fā)育毒性

在雌鼠中，TiO2-NPs的暴露會影響雌鼠體內激素水平，導致竇卵泡的募集減少，黃體功能不足，閉鎖卵泡水平升高等，最終使卵巢儲備功能明顯下降，出現(xiàn)卵巢低反應等現(xiàn)象，嚴重損傷雌鼠生殖功能[35]。不僅如此，一次性或長期吸入暴露均可在多時期(預備期、受精期和不孕期)對雌鼠的生殖器官產(chǎn)生不同影響，導致子宮靜脈局部白細胞水平和全身性炎癥指標顯著升高[36]。而機體內持續(xù)高水平的炎癥反應可能進一步影響卵巢功能，干擾受精卵在子宮內膜著床等重要的生殖進程，增加生化妊娠或早期胚胎丟失的發(fā)生風險。

對于雄性動物，TiO2-NPs暴露可以顯著影響睪丸發(fā)育，引起精子濃度下降以及精子活性減弱，從而干擾男性生殖健康。研究發(fā)現(xiàn)，TiO2-NP能夠通過血睪屏障，在睪丸部位的精子細胞與支持細胞中積累，引起小鼠睪丸病變，導致精子畸形率升高甚至睪丸病變的發(fā)生，對雄性生殖器官產(chǎn)生不可逆損害[37-38]。目前認為，這一損傷機制包括細胞內氧化自由基ROS水平過高引發(fā)的雄性生殖器官損傷，以及睪酮、催產(chǎn)素等性激素的分泌異常導致的雄性生殖功能減退等[39-40]。與女性生殖損傷類似，由于TiO2-NPs粒子能夠直接透過血睪屏障進入睪丸組織并長期殘留，因此容易在睪丸部位引起炎癥，產(chǎn)生細胞毒性，導致基因表達變化甚至配子內遺傳物質的變化，最終損害雄性生殖功能。

此外，在特殊生命時期TiO2-NPs顆粒物也會對親代與子代產(chǎn)生不同程度的影響[41]。如懷孕期間，由于TiO2-NPs可通過胎盤屏障，故母體暴露于TiO2-NPs時，二氧化鈦及二氧化鈦誘導產(chǎn)生的過量ROS引發(fā)的致畸作用以及心臟毒性[41]會對胎兒生長發(fā)育產(chǎn)生較為嚴重的影響，嚴重者甚至導致流產(chǎn)或胎兒死亡[42]。

2.3肝臟毒性 除神經(jīng)與生殖毒性外，TiO2-NPs還具有一定的肝臟毒性，主要體現(xiàn)在肝功能異常以及脂肪代謝紊亂兩方面，見表2。Silva等[43]的研究顯示，小鼠經(jīng)口暴露于TiO2-NPs后可導致肝功能異常，主要表現(xiàn)為血液中天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶和乳酸脫氫酶水平顯著升高，提示肝臟細胞受到明顯損傷，從而影響肝功能及脂質代謝。此外，解剖發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs暴露的小鼠除內臟脂肪增加外，還有明顯的脾腫大，說明TiO2-NPs暴露造成的肝功能損傷導致的脂質代謝紊亂可能誘導炎癥反應，累及免疫系統(tǒng)[43]。

表2 TiO2-NPs的肝臟毒性

TiO2-NPs最常見的肝臟毒性機制是誘導肝臟部位的氧化應激，經(jīng)口服、吸入以及皮膚攝入的方式進入人體血液循環(huán)并沉積在肝臟中，誘導局部炎癥反應，而炎癥因子的增加又會引起局部代謝水平上升，線粒體功能活躍，產(chǎn)生大量的過氧化物，過氧化物作用于肝臟，導致肝臟損傷[44]。研究發(fā)現(xiàn)，通過對機體補充還原性或抗氧化性物質(如具有強還原性的肉桂粉提取物及麝香草酚)，可明顯改善機體氧化還原狀態(tài)，降低丙二醛、活性氧類、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平，減輕TiO2-NPs對機體肝臟的損害[45-46]。因此，TiO2-NPs顆?？赡芡ㄟ^引起氧化應激水平升高導致肝臟損傷，進而引起其他臟器損傷。且TiO2-NPs長期暴露產(chǎn)生的這種肝損害是不可逆的，可能會對受試動物的遺傳物質產(chǎn)生損害[47]。

有研究顯示，在較低劑量下長時間暴露后，TiO2-NPs的毒代動力學可能與短期和高劑量暴露后的毒代動力學有很大不同[48]。16S核糖體RNA基因測序分析表明，大鼠腸道菌群的多樣性隨TiO2-NPs體內外暴露增加而呈劑量依賴性增加[48]。亞慢性口服TiO2-NPs 50 mg/kg后，大鼠糞便中的乳酸桿菌的豐度增加，導致腸道菌群的代謝功能發(fā)生變化[48]。腸道菌群的這一變化可能通過腸肝軸發(fā)生遷移，進而激活Janus激酶-信號轉導及轉錄激活因子信號通路，誘導肝臟炎癥的發(fā)生[49]。

此外研究發(fā)現(xiàn)，由于TiO2-NPs可以通過血腦屏障、血睪屏障和胎盤屏障，因此其可能在沉積分布部位誘發(fā)癌癥，故被國際癌癥研究機構歸類為2B類致癌物(可能對人類致癌)[50]。然而，Xia等[3]的體外研究提出，TiO2-NPs對肝臟癌細胞產(chǎn)生的損傷遠大于對正常細胞，其主要機制為TiO2-NPs上調了VDAC1的表達，導致線粒體功能障礙，進而產(chǎn)生細胞色素C等大量促凋亡物質，通過Janus激酶-信號轉導及轉錄激活因子信號通路從線粒體釋放到細胞質中并不可逆地激活胱天蛋白酶3，導致細胞內DNA大量降解并誘導HepG2細胞凋亡。提示可以利用TiO2-NPs對肝臟癌細胞的毒性來發(fā)揮抗腫瘤作用。但TiO2-NPs對肝臟正常細胞的安全性評價與對其他腫瘤的抗腫瘤活性效果仍有待進一步探索。

2.4呼吸系統(tǒng)毒性 除以上毒性外，部分研究還提示了TiO2-NPs具有一定的呼吸系統(tǒng)毒性。通常情況下，呼吸系統(tǒng)的毒性(或損傷)由生產(chǎn)性納米粉塵造成，粒徑越小生產(chǎn)粉塵在生產(chǎn)活動中漂浮的時間越長，越容易作為異物進入人體，造成損傷。此外，影響TiO2-NPs粉塵對人體損傷程度的因素還包括濃度、接觸時間、分散度、硬度、電荷性等。因此，通過積極開展不同類型的TiO2-NPs體內吸入式染毒實驗，以探究TiO2-NPs非物理性毒性十分有必要。

體外研究表明，TiO2-NPs對肺部遺傳物質及代謝具有一定影響，但其機制尚不明確[22,51]。而體內研究證明，TiO2-NPs對呼吸系統(tǒng)的損傷與諸多因素相關，目前關注度較高的為TiO2-NPs的晶體結構等影響因素[52-53]。Chézeau等[52]研究發(fā)現(xiàn)，金紅石晶體結構的TiO2-NPs會導致肺部強烈的急性炎癥反應，使得中性粒細胞大量涌入肺部組織，巨噬細胞充滿肺泡內腔，肺組織纖維化，這可能與炎癥和免疫反應基因的過度表達，發(fā)生補體-凝血級聯(lián)反應、氧化應激以及DNA損傷有關。Zhou等[53]研究發(fā)現(xiàn)，銳鈦礦晶體結構相的TiO2-NPs的長期呼吸暴露同樣會導致肺炎和肺纖維化，但其主要機制為銳鈦礦相TiO2-NPs在呼吸道暴露后產(chǎn)生過量的活性氧類或活性氮，激活了轉化生長因子-β/Smad/p38促分裂原活化的蛋白激酶/Wnt信號通路，最終導致小鼠肺毒性。然而也有研究否認這一觀點，認為TiO2-NPs的晶體結構與肺部組織的相關性并不十分明確[54]。因此，雖然TiO2-NPs的肺毒性表征已得到諸多證實，但其具體機制仍需進一步研究。

3 小 結

TiO2-NPs是近年來應用較為廣泛的納米金屬氧化物材料，其應用極大地促進了納米材料在生物醫(yī)藥、農(nóng)林種植與環(huán)境科學等領域的發(fā)展，有助于研發(fā)抗腫瘤藥物，提高農(nóng)作物產(chǎn)量與質量，保護生態(tài)環(huán)境等，然而其毒性作用以及安全效應尚不明確。因此，聯(lián)合體內外實驗，采用多種模式生物，采取多種暴露方式，對TiO2-NPs進行毒性及危險性評估，尋找TiO2-NPs應用的安全及有效劑量是目前亟須解決的問題。未來，應在安全暴露劑量內使用TiO2-NPs以促進各類科學技術的發(fā)展。