楊立波，張 謙，王 丹

（1.巴彥淖爾市醫(yī)院消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 臨河 015000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價(jià)研究中心；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院）

胃潰瘍是最普遍的胃腸道疾病之一，嚴(yán)重影響了人們的生活[1～3]。幽門螺桿菌感染是全世界胃慢性炎癥的最常見原因[4～9]。患者口服諸如阿莫西林，克拉霉素和甲硝唑等抗菌藥物來治療感染幽門螺桿菌取得了一定療效，但與此同時(shí)，患者對這些抗菌藥物的耐藥性也在逐年增加[10，11]。因此，迫切需要開發(fā)新的抗幽門螺桿菌的治療方法，尤其是中草藥，復(fù)發(fā)率低且副作用小[12～15]，易于獲得，在很大程度上減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

中藥復(fù)方黃連湯來源于《圣濟(jì)總錄》卷一七八，由黃連，干姜，艾葉和烏梅四味中藥組成，具有平調(diào)寒熱，和胃降逆的功效，本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為工具和實(shí)驗(yàn)方法，探究黃連湯治療胃潰瘍的的活性成分和主要作用靶標(biāo)，為其下一步機(jī)制作用的研究和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 黃連湯化合物成分收集

在Pubmed，中國知網(wǎng)和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索：黃連、干姜、艾葉、烏梅，以O(shè)B≥30%（oral bioavailability，生物利用度）和DL≥0.18（drug-likeness，類藥性）篩選黃連湯潛在活性成分以及這些活性成分所對應(yīng)的可能靶點(diǎn)，根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）對黃連湯潛在活性成分以及這些活性成分所對應(yīng)的可能靶點(diǎn)的名稱進(jìn)行縮寫標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 胃潰瘍發(fā)病機(jī)制相關(guān)的疾病基因的收集

在Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中以“gastric ulcer”為關(guān)鍵詞檢索與胃潰瘍發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因，對兩個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫里篩選得到的基因進(jìn)行整合，剔除重復(fù)基因，查閱文獻(xiàn)刪除無關(guān)基因，最后整理得到與胃潰瘍發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的疾病基因。

1.3 黃連湯-胃潰瘍交互靶點(diǎn)的獲取

將1.1和1.2中整理得到的txt文件導(dǎo)入R語言平臺，按照事先寫好的程序運(yùn)行R軟件后得到黃連湯-胃潰瘍交互靶基因，利用交互靶基因繪制韋恩圖。

1.4 黃連湯復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)行R軟件后得到黃連湯-胃潰瘍交互靶基因，將此交互靶基因txt文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，然后對黃連湯成分以及作用靶點(diǎn)等屬性進(jìn)行標(biāo)示，運(yùn)行軟件，調(diào)整修飾后導(dǎo)出黃連湯復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建黃連湯-胃潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因txt文件導(dǎo)入STRING在線網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/cgi/input.pl），相互作用評分閾值＞0.900，研究對象選擇人種，對于網(wǎng)絡(luò)脫節(jié)的游離基因進(jìn)行隱藏，導(dǎo)出黃連湯-胃潰瘍蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和string_interactions文件。

1.6 通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)獲取核心基因

將1.5中獲得的string_interactions導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，利用cytoNCA插件對BC（betweenness）、CC（closeness）、DC（degree）、EC（eigenvector）、LAC（local average connectivity-based method）進(jìn)行兩次打分，根據(jù)得分大于中位值的基因，篩選作為PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.7 GO與KEGG通路富集分析

將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因txt文件導(dǎo)入R平臺進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫與KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析。富集分析皆以P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 黃連湯化合物成分收集

通過Gene Card、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到5148個(gè)胃潰瘍相關(guān)靶點(diǎn)基因。運(yùn)用R語言得到藥物-疾病交互靶點(diǎn)148個(gè)（見圖1）。

圖1 黃連湯-胃潰瘍交互靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

此網(wǎng)絡(luò)中有23個(gè)主要化合物成分，有148個(gè)胃潰瘍疾病靶點(diǎn)（見圖2）。主要化合物成分及作用靶點(diǎn)圖如表1所示。

圖2 化合物-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表1 主要成分及靶點(diǎn)

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及其網(wǎng)絡(luò)核心的篩選

PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3A所示。經(jīng)過兩次打分BC≥66.977486385，CC≥0.2036639875，DC≥6，EC≥0.0363098645，LAC≥2，NC≥3.05和BC≥15.40516585，CC≥0.526315789，DC≥8，EC≥0.122935086，LAC≥4，NC≥5.219516595，根據(jù)得分大于中位值，最終共篩選出網(wǎng)絡(luò)核心基因15個(gè)，分別為TP53、CDKN1A、AKT1、HIF1α、FOS、MYC、JUN、EGFR、NR3C1、MAPK1、RB1、CCND1、ESR1、RELA、MAPK8（見圖3C）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

2.4 GO數(shù)據(jù)庫富集分析

運(yùn)用R軟件將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫富集分析（見圖4），GO數(shù)據(jù)庫富集分析共計(jì)2412條，包括2152條生物學(xué)過程（biological process，BP），190條分子功能（Molecular Function,MF）和70條細(xì)胞成分（cellular component，CC）。設(shè)定P＜0.05為閾值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾，按照P值由小到大分別選取生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞成分中前10條通路繪制GO通路圖。

圖4 GO富集分析

2.5 KEGG富集結(jié)果分析

運(yùn)用R軟件將黃連湯-胃潰瘍交互靶基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集分析，總計(jì)得到160條涉及黃連湯-胃潰瘍相關(guān)信號通路，設(shè)定P＜0.05為閾值標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過濾，按照P值由小到大選取前30條通路繪制KEGG信號通路圖（見圖5）。

圖5 KEGG富集分析

3 討論

本研究篩選到的黃連湯治療胃潰瘍的主要活性成分為黃連堿、β谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，均具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、增強(qiáng)機(jī)體免疫等多種藥理作用，說明這幾種化合物可能是黃連湯治療胃潰瘍的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)TP53、CDKN1A、AKT1、HIF1α、EGFR可能是黃連湯治療胃潰瘍的關(guān)鍵靶點(diǎn)。TP53信號通路異常激活可能是其對酒精和阿司匹林致胃潰瘍損傷保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。CDKN1A作為細(xì)胞內(nèi)信使調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與胃潰瘍甚至胃癌直接相關(guān)。Akt信號通路在大鼠胃潰瘍的發(fā)生和愈合過程起到關(guān)鍵作用。HIF-1α被確定為與幽門螺桿菌感染激活的細(xì)胞周期停滯傳遞的介體。EGF基因與受體EGFR在特定細(xì)胞表面相互作用并且結(jié)合后，能夠激活一系列細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移達(dá)到增加傷口愈合的作用。同樣的，EGF受體所介導(dǎo)的下游Ras/Raf/ERK1/2信號通路，也在特定類型的細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

GO分析結(jié)果顯示，黃連湯治療胃潰瘍涉及的生物學(xué)過程主要包括對氧化應(yīng)激、脂多糖及活性氧等于氧化應(yīng)激相關(guān)的反應(yīng)，這些反應(yīng)均與免疫和炎癥相關(guān)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于AGE-RAGE、TNF、IL-17、P53、HIF-1等與免疫、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路。因此，我們推測，藥物有效成分可能通過AGE-RAGE、MAPK、P53、HIF-1等炎癥信號通路以及Ras/Raf/ERK1/2通路上的不同靶點(diǎn)來達(dá)到治療胃潰瘍的目的。

綜上所述，黃連湯在“多成分-多途徑-多靶點(diǎn)”協(xié)同調(diào)控的背景下發(fā)揮治療胃潰瘍，并起到抗氧化、抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)作用。與此同時(shí)，由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)只是網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)的整合和統(tǒng)計(jì)，因此，在一定程度上具有局限性，只能作為續(xù)基礎(chǔ)的理論階段。在下一步的研究中心，我們將會圍繞網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中得到的黃連湯活性成分、作用靶點(diǎn)及治療胃潰瘍相關(guān)信號通路作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，從而為黃連湯治療胃潰瘍提供可靠的科學(xué)依據(jù)，也為后續(xù)治療胃潰瘍藥物研發(fā)打下基礎(chǔ)。