王立紅，呂秀云，白 俠，康世榮，所 鴻，徐 鵬，楊 婷

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科）

乏氧微環(huán)境通過復(fù)雜機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并與不良預(yù)后密切相關(guān)，也是腫瘤對(duì)放化療、免疫治療、靶向治療等多種抗癌療法產(chǎn)生抵抗的重要因素[1]。因此，乏氧檢測(cè)對(duì)腫瘤研究有著重要的意義。乏氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducedfactor-1，HIF-1）是細(xì)胞在乏氧應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成，誘導(dǎo)參與細(xì)胞增殖、凋亡、糖代謝、pH調(diào)節(jié)和血管生成的多個(gè)基因的表達(dá)上調(diào)，其中HIF-1α在腫瘤發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用[2]。一種膜相關(guān)的含鋅金屬酶是碳酸酐酶9（carbonic anhydrase 9，CA9），它在腫瘤酸堿平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且有利于腫瘤細(xì)胞在酸性微環(huán)境中生存，增強(qiáng)了其遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[3]，在各種人類腫瘤中過度表達(dá)，并與預(yù)后和治療效果相關(guān)。本研究采用免疫組化方法分析NSCLC原發(fā)灶組織中HIF-1α、CA9的表達(dá)與PET-CT SUV max值的相關(guān)性及其對(duì)病人預(yù)后的一些影響。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇

2015-10～2017-12內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院45例經(jīng)活檢病理診斷的NSCLC病人，于胸外科進(jìn)行手術(shù)切除治療，術(shù)式為肺葉切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。病理切片由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師作出診斷。45例病人中，男病人29例，女病人16例，平均年齡為59.1歲，其中鱗癌有17例，腺癌有28例，IA期有31例，IB期有6例，IIA期有3例，IIB期有5例，腫瘤直徑（22.80±13.04）mm。術(shù)后I期病人均無其他輔助抗腫瘤治療，II期的8例病人中有6例完成4周期含鉑兩藥化療方案，有2例未進(jìn)行化療。

1.2 病理免疫檢測(cè)

1.2.1 主要試劑HIF-1α抗體，CA9抗體；FITC標(biāo)記IgG，HRP標(biāo)記IgG。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法腫瘤石蠟包埋標(biāo)本以3μm層厚連續(xù)切片，每例標(biāo)本先進(jìn)行HE染色作為對(duì)照并作形態(tài)學(xué)判定。采用間接免疫熒光組織化學(xué)和免疫酶組織化學(xué)染色方法。HIF-1α，CA9一抗以1：100稀釋，熒光二抗和HRP二抗以1：300稀釋。切片經(jīng)烤片、脫蠟、微波抗原修復(fù)后孵育一抗、二抗。陰性對(duì)照：參照HE染色切片，以同一切片內(nèi)的正常組織細(xì)胞作為陰性內(nèi)對(duì)照?？瞻讓?duì)照：以PBS緩沖液代替一抗工作液。陽性對(duì)照：以試劑公司提供的陽性結(jié)果圖片作為參照。

1.2.3 結(jié)果判讀免疫熒光組織化學(xué)染色以細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，CA9陽性著色為細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，HIF-1α陽性著色為細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光。免疫酶組織化學(xué)染色定量分析：HIF-1α以細(xì)胞核著色為陽性標(biāo)記，CA9以細(xì)胞膜著色為陽性標(biāo)記，陽性著色為棕黃色，采用半定量分析方法測(cè)定陽性細(xì)胞百分比：每組內(nèi)每個(gè)因子每張切片隨機(jī)挑選不得少于5個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照，拍照時(shí)要讓組織充滿整個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%），參照Baardwijk等人的判讀方法[4]，陽性細(xì)胞百分比≥25%判斷為陽性。

1.3 PET-CT檢查

檢查前病人禁食6h以上，血糖＜6mmol/L，靜脈注射18F-FDG，由2名以上核醫(yī)學(xué)醫(yī)師對(duì)肺癌病灶進(jìn)行分析。

1.4 術(shù)后定期復(fù)查隨訪

病人術(shù)后第1年要每3個(gè)月復(fù)查一次、第2年要每6個(gè)月復(fù)查一次，第3年及以后要每年復(fù)查一次，復(fù)查內(nèi)容有常規(guī)體格檢查、胸部CT、腹部增強(qiáng)CT、頭顱核磁、骨掃描，淺表淋巴結(jié)彩超等。隨訪時(shí)間與病人復(fù)查時(shí)間同步，隨訪截止時(shí)間為2019-12-31，發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移事件后隨訪不終止，發(fā)生死亡事件時(shí)隨訪終止。隨訪內(nèi)容包括上述檢查結(jié)果，通過查閱病人門診、住院病歷資料以及電話聯(lián)系方式進(jìn)行隨訪。用無病生存期DFS評(píng)估預(yù)后，DFS定義為自手術(shù)之日起，至出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、與腫瘤相關(guān)的死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析各因子表達(dá)水平與臨床特征的相關(guān)性，對(duì)于連續(xù)數(shù)據(jù)，不同組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線圖像，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，在單因素分析中P＜0.05的因素可進(jìn)入多因素回歸分析；相關(guān)性分析采用Pearson分析，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及隨訪結(jié)果

45例病人平均隨訪時(shí)間35個(gè)月（8～51個(gè)月），中位隨訪時(shí)間36個(gè)月，失訪0人，最后1次隨訪時(shí)存活42人。45例中共計(jì)8例復(fù)發(fā)（包括轉(zhuǎn)移、死亡病例），其中I期3例均存活，II期復(fù)發(fā)5例中有3例死亡。45例病人平均DFS 33個(gè)月，3年OS 93%。術(shù)前腫瘤原發(fā)灶直徑＞32.5mm組病人DFS較差（P＜0.001）（見圖1），臨床分期II期組的病人DFS較差（P＜0.001）（見圖2）；單因素線性回歸顯示腫瘤直徑、腫瘤分期與DFS呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）（見表5），病理類型、年齡、性別與DFS無明顯相關(guān)性（P=0.08，P=0.07，P=0.17）；多因素分析中腫瘤直徑與DFS呈負(fù)相關(guān)，是早期NSCLC根治術(shù)后病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.003）。

圖1 腫瘤原發(fā)灶直徑（mm）與無病生存期

圖2 腫瘤臨床分期與病人無病生存期

2.2 PET-CT SUV max結(jié)果

45例病人PET-CT SUV max均數(shù)6.95，中位數(shù)6.17，生存曲線示SUV＞9.2組病人DFS低于SUV≤9.2組（P＜0.001）（見圖3），兩組平均DFS為16.9個(gè)月vs 37.1個(gè)月。SUV max＞9.2組3年OS率66.7%，3年DFS 33.3%；SUV max≤9.2組3年OS 100%，3年DFS 94.4%。復(fù)發(fā)病人共8例中有6例SUV max＞9.2，其中3例為死亡病例。單因素線性回歸分析顯示SUV max與DFS呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001）（見表5），多因素回歸分析顯示SUV max是早期NSCLC根治術(shù)后病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.001）（見表6）。

圖3 SUV max與病人DFS

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（見圖4、5）

圖4 NSCLC組織CA9免疫組化結(jié)果 染色陽性為癌細(xì)胞胞膜呈棕黃色（200x）

（1）本研究HIF-1α陽性表達(dá)有27例（60%），其中腺癌有13例，鱗癌有14例，CA9陽性表達(dá)有21例（46.7%），其中腺癌有9例，鱗癌有12例，HIF-1α、CA9共表達(dá)。20例（44.4%），二者在內(nèi)對(duì)照及空白對(duì)照組中表達(dá)均為陰性。χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)結(jié)果顯示HIF-1α的陽性表達(dá)與性別及病理類型有關(guān)（P=0.022，P=0.017）（見表1、2），不受病人年齡、腫瘤分期、腫瘤直徑的影響（P＞0.05），HIF-1α在鱗癌中陽性表達(dá)率82.4%，在腺癌中陽性表達(dá)率46.4%；CA9表達(dá)與性別、病理類型、臨床分期、腫瘤直徑有關(guān)（P＜0.05），不受年齡影響（P＞0.05），在鱗癌中陽性表達(dá)70.6%，在腺癌中表達(dá)32.1%（見表1、3）；（2）HIF-1α、CA9、SUV max之間的相互關(guān)系：Pearson相關(guān)性分析顯示HIF-1α和CA9的表達(dá)具有相關(guān)性（r=0.693，P＜0.001），HIF-1α與SUV max具有相關(guān)性（r=0.783，P＜0.001），CA9表達(dá)與SUV max具有相關(guān)性（r=0.793，P＜0.001）（見表4）；（3）HIF-1α、CA9與DFS：?jiǎn)我蛩鼐€性回歸分析顯示HIF-1α、CA9表達(dá)與病人DFS呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001）（見表5）。多因素分析顯示HIF-1α、CA9表達(dá)不是NSCLC病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.72，P=0.14）（見表6）。

表1 HIF-1α、CA9與臨床特征的關(guān)系

表4 HIF-1α、CA9、SUV max Pearson相關(guān)性分析

表5 單因素線性回歸分析

表6 多因素回歸分析

3 討論

在臨床實(shí)踐中，18F-FDG PET-CT成像常被用于惡性腫瘤的診斷、分期、治療計(jì)劃和治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)，腫瘤FDG攝取是肺癌病人預(yù)后的重要影響因素[5]。本研究由于納入樣本量較少，且研究對(duì)象為早期病人，隨訪時(shí)間短，3年總體生存率高達(dá)93%，所以在生存分析中我們通過DFS評(píng)判病人預(yù)后，根據(jù)ROC確立的SUV max的cut off值為9.2，以此分為高低兩組病人，生存曲線示兩組病人的DFS差異具是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的（P＜0.001），＞9.2組病人平均DFS為16.9個(gè)月，而≤9.2組病人平均DFS為37.1個(gè)月；在單因素分析中SUV max值與DFS呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），多因素分析結(jié)果顯示SUV max是病人的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.001），與大部分的研究結(jié)果相符[6]，本研究顯示SUV max升高提示NSCLC病人預(yù)后不良。

圖5 NSCLC組織HIF1α免疫組化結(jié)果 染色陽性為癌細(xì)胞胞核呈棕褐色（200x）

表2 HIF-1α與腫瘤直徑、年齡的關(guān)系

表3 CA9與腫瘤直徑、年齡的關(guān)系

18F-FDG攝取作為一種乏氧檢測(cè)方法，其基本原理是乏氧可增加癌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解酶的表達(dá)，使葡萄糖氧化向糖酵解方向轉(zhuǎn)變，F(xiàn)DG通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，在胞漿中積累，因此PET成像可直接反映腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝活性，識(shí)別高代謝的腫瘤亞單位，這些單位更容易局部復(fù)發(fā)。Pugachev等人發(fā)現(xiàn)FDG攝取與腫瘤組織乏氧標(biāo)記物染色呈正相關(guān)[7]，我們的研究也顯示HIF-1α、CA9的表達(dá)量與SUV max呈正相關(guān)（r=0.783，P＜0.001）（r=0.793，P＜0.001）。乏氧微環(huán)境是肺癌耐藥、預(yù)后差的重要原因之一，而SUV max與乏氧標(biāo)記物HIF-1α、CA9的表達(dá)呈正相關(guān)，這也進(jìn)一步印證了SUV max對(duì)NSCLC病人預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，同時(shí)證明了PET-CT在腫瘤乏氧檢測(cè)中的價(jià)值。

HIF-1α、CA9是肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要分子事件，它們的表達(dá)與血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡抑制、細(xì)胞粘附破壞的蛋白的表達(dá)都有相關(guān)性。HIF-1α、CA9在肺癌中表達(dá)情況的相關(guān)研究較多，大部分都得出了它們與肺癌病人不良預(yù)后的相關(guān)性[8～11]。本研究中HIF-1α陽性有27例（60%）、CA9陽性有21例（46.7%），二者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.693，P＜0.001），單因素分析顯示HIF-1α、CA9與病人DFS呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001），而多因素分析顯示HIF-1α、CA9并不是病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。筆者認(rèn)為HIF-1α、CA9在單因素分析中的結(jié)果可能與其他因素協(xié)同，比如，我們?cè)趯?duì)臨床資料的分析中發(fā)現(xiàn)CA9陽性表達(dá)組腫瘤直徑較大（28.60 vs 17.73mm），CA9表達(dá)與腫瘤直徑呈正相關(guān)（t=2.996，P=0.005），而腫瘤直徑與DFS呈負(fù)相關(guān)，所以CA9的陽性表達(dá)對(duì)于DFS的作用可能與腫瘤直徑密切相關(guān)。在免疫組化與臨床因素的關(guān)系中我們還有一些發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的陽性表達(dá)與病理類型有關(guān)，在鱗癌病人中陽性表達(dá)率是82.4%，在腺癌病人中陽性率是46.4%；CA9表達(dá)與病理類型、臨床分期、腫瘤直徑都有關(guān)，在鱗癌中陽性表達(dá)率是70.6%，在腺癌中陽性表達(dá)率是32.1%。HIF-1α、CA9在鱗癌中的表達(dá)率是比較高的，提示鱗癌的乏氧情況比腺癌更嚴(yán)重，這也可以解釋鱗癌更易發(fā)生壞死的原因。CA9與腫瘤分期、腫瘤直徑的相關(guān)性進(jìn)一步印證了CA9的表達(dá)與病人DFS的負(fù)相關(guān)。

HIF-1α表達(dá)的組織定位主要位于腫瘤浸潤的邊緣部分，呈彌漫性，并不局限于壞死灶，在癌細(xì)胞中表達(dá)，在間質(zhì)細(xì)胞、癌旁組織也有散在表達(dá)，亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞核，同時(shí)也有細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。CA9表達(dá)情況與HIF-1α有所不同，其組織定位多見于腫瘤壞死周圍部分，形態(tài)呈現(xiàn)局灶性，沒有觀察到較大面積成片彌漫狀的表達(dá)，在間質(zhì)細(xì)胞及癌旁組織幾乎無表達(dá)，其亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，胞膜表達(dá)更為明顯。二者在組織中的位置分布以及表達(dá)量均有不同，這說明了HIF-1α、CA9在腫瘤中的表達(dá)除了受到乏氧直接誘導(dǎo)外，還各自受到其他的通路調(diào)控。我們還發(fā)現(xiàn)，不論是陽性病例數(shù)，還是陽性表達(dá)病人組織中的表達(dá)量，HIF-1α的表達(dá)均高于CA9，這可能是由于乏氧可誘導(dǎo)CA9的表達(dá)，而CA9表達(dá)在一定程度上依賴于HIF-1α通路[12]。腫瘤乏氧標(biāo)記物HIF-1α、CA9表達(dá)在早期NSCLC病人中具有顯著正相關(guān)性，并與DFS呈負(fù)相關(guān)，這也提示了我們乏氧標(biāo)記物可能成為惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)，事實(shí)上，已有乏氧靶向抗癌藥物在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中呈現(xiàn)療效[13]。所以對(duì)病人的腫瘤組織進(jìn)行HIF-1α、CA9檢測(cè)有助于判斷術(shù)后早期NSCLC病人的預(yù)后，為臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)，對(duì)高表達(dá)的病人可以聯(lián)合PET-CT SUV max值，對(duì)綜合判斷預(yù)后具有重要意義。

應(yīng)當(dāng)承認(rèn)的是，本研究有一定的局限性，樣本量較小，特別是大多數(shù)為I期病人，回顧性設(shè)計(jì)可能導(dǎo)致選擇或信息偏移，而且組織切片的特點(diǎn)并不能反映整個(gè)瘤體的情況，這也是所有病理組織實(shí)驗(yàn)的共同缺點(diǎn)。

綜上，PET-CT SUV max是早期根治術(shù)后NSCLC病人預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，早期NSCLC肺癌組織中乏氧標(biāo)記物HIF-1α、CA9的檢測(cè)將為腫瘤靶向治療提供新思路。PET-CT SUV max、HIF-1α、CA9三者聯(lián)合檢測(cè)可能有助于判斷早期根治術(shù)后NSCLC病人預(yù)后。