王軍 王劍 魯敏 牧亭亭 耿亞會(huì)

摘要 目的：探討異補(bǔ)骨脂素通過(guò)PPAR-γ-Axin2-Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)對(duì)大鼠骨代謝的影響。方法：選擇雌性大鼠40只，隨機(jī)分為模型組和異補(bǔ)骨脂素組，各20只，實(shí)驗(yàn)12周后，對(duì)大鼠骨密度、骨組織形態(tài)進(jìn)行觀察，并檢測(cè)各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)情況，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：12周后，模型組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均低于異補(bǔ)骨脂素組（P<0.05）;異補(bǔ)骨脂素組大鼠血清鈣、磷及抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase，TRACP）水平低于模型組，血清堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）水平高于模型組（P<0.05）;骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果顯示，模型組大鼠骨小梁稀疏、斷裂明顯，而異補(bǔ)骨脂素組大鼠骨小梁面積百分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)目明顯增加，骨小梁分離度明顯下降（P<0.05）。12周后，與模型組比較，異補(bǔ)骨脂素組PPAR-γ和Axin2蛋白水平下調(diào)，β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）。結(jié)論：異補(bǔ)骨脂素可能通過(guò)抑制Axin2/PPAR-γ信號(hào)通路，激活Wnt信號(hào)通路，改善大鼠骨代謝。

關(guān)鍵詞 異補(bǔ)骨脂素;骨質(zhì)疏松;骨代謝;骨組織形態(tài);Wnt信號(hào)通路;PPAR-γ蛋白;Axin2蛋白;β-catenin蛋白

Effects of Isopsoralen on Bone Metabolism in Rats Via PPAR Gamma-Axin 2-Wnt Signal Regulation

WANG Jun，WANG Jian，LU Min，MU Tingting，GENG Yahui

（Department of Traumatic Orthopaedics，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010000，China）

Abstract Objective：To investigate the effects of isopsoralen on bone metabolism in rats through PPAR-gamma-Axin2-Wnt signal regulation.Methods：A total of 40 female rats were randomly divided into a model group and an isopsoralen group with 20 rats in each group.After 12 weeks of experiment，the bone mineral density（BMD） and bone histomorphology of rats were observed，and the biochemical indexes of bone metabolism in serum of rats in each group were detected.The expressions of PPAR-gamma，Axin 2 and beta-catenin protein were detected by Western blotting.Results：After 12 weeks，BMD values of femur，pelvis，spine and whole body in model group were lower than those in isopsoralen group（P<0.05）; serum Ca，P and TRACP levels in isopsoralen group were lower than those in model group，and serum ALP levels were higher than those in model group（P<0.05）; bone histomorphometric analysis showed that the trabeculae of model group were sparse and fractured obviously.The percentage of bone trabecular area and the number of bone trabeculae increased significantly，and the degree of trabecular segregation decreased significantly（P<0.05）.After 12 weeks，compared with model rats，PPAR-gamma and Axin 2 protein levels in isopsoralen group were down-regulated and beta-catenin protein expression was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Isopsoralen may improve the abnormal bone metabolism in rats by inhibiting Axin2/PPAR gamma signaling pathway，activating Wnt signaling pathway and improving bone metabolism in rats.

Keywords Isopsoralen; Osteoporosis; Bone metabolism; Bone histomorphology; Wnt signaling pathway; PPAR-γ protein; AXIN2 protein; β-Catenin protein

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.011

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是臨床常見(jiàn)的全身性骨骼疾病，其特征表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構(gòu)受損、骨量降低及骨脆性增加[1]。OP易導(dǎo)致骨折，引起患者致殘和致死率增高，嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量[2]。目前OP已成為全球范圍的一個(gè)公共健康問(wèn)題，因此，對(duì)OP的防治具有重要的臨床意義[3]。目前臨床上OP的藥物治療雖然具有一定療效，但其不良反應(yīng)較多，且經(jīng)濟(jì)成本較高，因此探尋一種安全、不良反應(yīng)小、費(fèi)用低廉的藥物治療方法顯得十分必要[4]。異補(bǔ)骨脂素是從豆科植物中提取的一種香豆素類化合物，具有促進(jìn)骨代謝的作用[5]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討異補(bǔ)骨脂素調(diào)控大鼠PPAR-γ-Axin2-Wnt信號(hào)通路的機(jī)制及對(duì)骨代謝的影響，為防治OP提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用6月齡雌性健康大鼠[動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)：SCXK（京）2018-0013]40只，均購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，所有大鼠自由飲水?dāng)z食。本研究經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批號(hào)：20180121）。

1.1.2 藥物

地塞米松鈉注射液（天津藥業(yè)焦作有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H41020035）、異補(bǔ)骨脂素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：20180122）。

1.1.3 試劑與儀器

骨密度儀（NORLAND公司，美國(guó)，型號(hào)：XR-46）、電子天平（日本島津公司，型號(hào)：AEL-40SM）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司，型號(hào)：Read Max 1900Plus）、顯微鏡（日本OLYMPUS公司，型號(hào)：Olympus IX71）、電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：Bio-RaD）;鈣（Ca）檢測(cè)試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：180103）、磷（P）檢測(cè)試劑盒（寧波博泰生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：170903）、堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒（寧波博泰生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：171104），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）檢測(cè)試劑盒（寧波博泰生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180115）、PPAR-γ抗體（美國(guó)Ssanta Cruz公司，批號(hào)：180112）、β-catenin抗體（美國(guó)Ssanta Cruz公司，批號(hào)：180107）和Axin2抗體（美國(guó)SsSanta Cruz公司，批號(hào)：180110）;Trizol總RNA提取試劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：180103）、Western blotting及凝膠電泳試劑（南京凱基生物有限公司，批號(hào)：171014）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將40只健康大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和異補(bǔ)骨脂素組，每組20只。各組大鼠右側(cè)臀部肌內(nèi)注射地塞米松鈉注射液（2.5 mg/kg），每周2次，連續(xù)注射12周。

1.2.2 給藥方法 自造模之日起，模型組大鼠給予10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，異補(bǔ)骨脂素組給予異補(bǔ)骨脂素混懸液治療，劑量為25 mg/（kg·d），每周停1 d，連續(xù)治療12周，期間密切觀察各組大鼠的生理反應(yīng)及生活習(xí)性變化情況。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

大鼠骨密度及血清骨代謝檢測(cè)：12周后將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，采用骨密度儀對(duì)各組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)完畢后，腹部脫毛后正中縱切開(kāi)、分離肌肉和筋膜，將腹動(dòng)脈暴露，抽取2.0 mL血液樣本，然后將腹動(dòng)脈結(jié)扎。血標(biāo)本采用離心機(jī)離心（離心半徑：10 cm）10 min，取上清，-80 ℃?zhèn)浯娲郎y(cè)。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清鈣、磷、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase，TRACP）水平，嚴(yán)格按照相關(guān)劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。

大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：12周后將各組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，處死大鼠，進(jìn)行解剖，取第四腰椎骨（L4），放入冷處理后的2.5%戊二醛中固定12 h，常溫下脫鈣至大頭針能刺進(jìn)骨密質(zhì)為止，包埋劑進(jìn)行包埋，切片機(jī)冰凍切片（厚度15 μm），粘貼于載玻片上，-20 ℃?zhèn)浯娲郎y(cè)。采用改良番紅O-固綠軟骨染色液試劑盒染色處理后，進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，每只大鼠取3張切片，每張切片觀察2個(gè)視野，顯微鏡觀察并拍照，采用Image-Pro Plus彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對(duì)骨小梁形態(tài)進(jìn)行分析，觀察骨小梁面積百分?jǐn)?shù)、骨小梁分離度及骨小梁數(shù)目情況。

PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白表達(dá)：采用Western blotting法檢測(cè)骨組織PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白表達(dá)：12周后，處死大鼠取右側(cè)股骨頭，碾碎后倒入勻漿器，加入裂解液混勻，按照Trizol總RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取總蛋白，-80 ℃下凍存，將總蛋白溶入等體積的緩沖液中煮沸10 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離蛋白，然后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride）上，放入封閉液中搖動(dòng)1 h，加入一抗（PPAR-γ、β-catenin和Axin2抗體均為1∶500稀釋）孵育，4 ℃下過(guò)夜。二抗孵育（1∶200 0稀釋）12 h，免疫熒光增強(qiáng)法顯色，PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表達(dá)量與GAPHD的灰度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠的骨密度情況

12周后，異補(bǔ)骨脂素組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 2組大鼠血清骨代謝情況

12周后，異補(bǔ)骨脂素組大鼠血清鈣、磷及TRACP水平低于模型組，血清ALP水平高于模型組大鼠（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 2組大鼠骨組織形態(tài)情況

12周后，骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果顯示，與補(bǔ)骨脂素組大鼠比較，模型組大鼠骨小梁稀疏、斷裂明顯（圖1），而異補(bǔ)骨脂素組大鼠骨小梁面積百分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)目明顯增加，骨小梁分離度明顯下降（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 2組大鼠骨組織PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表達(dá)情況

12周后，與模型組大鼠比較，異補(bǔ)骨脂素組PPAR-γ和Axin2蛋白水平下調(diào)，β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）。見(jiàn)表4，圖2。

3 討論

OP是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快，OP的發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[6]。OP主要是骨吸收和骨形成的骨代謝失衡引起[7]。受各種因素影響（年齡、內(nèi)分泌、遺傳及環(huán)境等因素），骨形成減弱或骨吸收增強(qiáng)時(shí)，機(jī)體會(huì)發(fā)生OP，并會(huì)呈持續(xù)性發(fā)展，極易導(dǎo)致各種骨折發(fā)生，給患者的生命質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重影響，因此對(duì)OP的防治具有十分重要的臨床意義[8-9]。大鼠是OP動(dòng)物模型最常用的動(dòng)物之一，其OP模型穩(wěn)定性好，并可重復(fù)[10]。本研究通過(guò)地塞米松誘導(dǎo)建立OP大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)研究人類OP有著積極的指導(dǎo)意義。

臨床上對(duì)OP的藥物治療常采用雌激素替代療法，可有效延緩OP病情的發(fā)展，但其引起水腫、高血壓及癡呆等不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高[11]。近年來(lái)尋找和篩選中藥中與雌激素相類似的實(shí)驗(yàn)研究成為熱點(diǎn)。植物雌激素是存在于植物中的一種活性成分，可與雌激素受體特異性的結(jié)合，發(fā)揮治療OP的效果，又可避免不良反應(yīng)[12]。異補(bǔ)骨脂素是從豆類植物中提取的一種化學(xué)活性成分，具有溫脾止瀉、溫補(bǔ)腎陽(yáng)的功效[13]。相關(guān)研究證實(shí)，異補(bǔ)骨脂素可促進(jìn)骨代謝，起到防治骨質(zhì)疏松的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，12周后，異補(bǔ)骨脂素組大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型組，異補(bǔ)骨脂素組大鼠骨小梁面積百分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)目明顯增加，骨小梁分離度明顯下降。這可能是因?yàn)楫愌a(bǔ)骨脂素可發(fā)揮類似雌激素的作用，可有效控制大鼠的骨量流失，促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖，一定程度改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，起到防治OP的作用。

鈣和磷是機(jī)體必需的微量元素，可在骨代謝中起到重要作用[15]。ALP可由成骨細(xì)胞分泌，可參與成骨細(xì)胞的分化、增殖及遷移，可作為反映成骨細(xì)胞變化的標(biāo)志物[16]。TRACP可由破骨細(xì)胞分泌，可反映破骨細(xì)胞的活性[17]。本研究結(jié)果顯示，12周后，異補(bǔ)骨脂素組大鼠血清鈣、磷及TRACP水平低于模型組，血清ALP水平高于模型組大鼠（P<0.05），這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)異補(bǔ)骨脂素治療，可有效刺激成骨細(xì)胞的骨形成，ALP水平上升，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的骨吸收，TRACP水平下降，另外可降低血清鈣和磷水平，促進(jìn)破骨細(xì)胞活性和骨吸收，促進(jìn)骨代謝效果。

骨髓細(xì)胞大部分為脂肪細(xì)胞，其在骨代謝方面具有重要的作用，脂質(zhì)代謝紊亂被認(rèn)為可能是骨質(zhì)疏松的病因之一[18]。PPAR-γ蛋白是一種核激素受體，會(huì)抑制成骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，造成骨形成減弱，并可促進(jìn)破骨細(xì)胞發(fā)育，造成骨吸收增加[19]。PPAR-γ可促進(jìn)骨髓細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂[20]。Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化和增殖中起重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信號(hào)通路的主要成分，可啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路[21]。Axin2是一種骨架蛋白，可抑制Wnt信號(hào)通路的激活[22]。本研究結(jié)果顯示，12周后，與模型組大鼠比較，異補(bǔ)骨脂素組PPAR-γ和Axin2蛋白水平下調(diào)，β-catenin蛋白表達(dá)明顯增加。這可能是因?yàn)楫愌a(bǔ)骨脂素可有效抑制下調(diào)PPAR-γ表達(dá)，減少骨髓內(nèi)的脂肪組織堆積，避免骨髓脂質(zhì)代謝紊亂。通過(guò)減少PPAR-γ的活化，可間接下調(diào)Axin2的表達(dá)，抑制Axin2/PPAR-γ信號(hào)通路參與脂質(zhì)代謝，并可阻斷Axin2對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制，上調(diào)β-catenin蛋白表達(dá)，使β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，最終啟動(dòng)Wnt信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠骨髓脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響其骨代謝，促進(jìn)骨形成。

綜上所述，異補(bǔ)骨脂素可能通過(guò)抑制Axin2/PPAR-γ信號(hào)通路，激活Wnt信號(hào)通路，改善大鼠骨代謝異常，促進(jìn)骨形成，可為OP防治新藥物的開(kāi)發(fā)提供新思路，帶來(lái)良好的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。

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（2019-06-19收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）