杭紅，任麗娜，施麗君

(上海藥明奧測(cè)醫(yī)療科技有限公司，上海 200125)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是非常常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，我國(guó)CC發(fā)病率高居世界第2位，每年新發(fā)病例在10萬(wàn)人以上，死亡病例約3萬(wàn)人，極大威脅著女性的健康[1]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus， HPV)感染是CC發(fā)病的主要原因。目前，CC的治療方法包括手術(shù)治療、化療、放療、靶向治療以及免疫治療。傳統(tǒng)治療方式對(duì)早期CC的治療效果較好，5年生存率可達(dá)91.5%，但對(duì)轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性CC的療效十分有限[2]。免疫治療通過(guò)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)提高其抗腫瘤免疫效應(yīng)，已逐步成為CC治療的新模式。

腫瘤免疫治療成為當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其中以PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑的研究和應(yīng)用為熱點(diǎn)。PD-1是自凋亡的T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種免疫抑制性受體，其主要配體為PD-L1，兩者結(jié)合傳導(dǎo)免疫抑制信號(hào)，導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和免疫殺傷[3]。PD-1/PD-L1抑制劑可以阻斷兩者的結(jié)合，阻斷負(fù)向調(diào)控信號(hào)，使T細(xì)胞恢復(fù)活性，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[4]。目前已有8款與PD-1/PD-L1相關(guān)的抗體藥物在國(guó)內(nèi)上市，適應(yīng)癥主要為黑色素瘤、肺癌、淋巴癌等。同時(shí)，國(guó)際上已有多款PD-1/PD-L1藥物的伴隨診斷產(chǎn)品上市[5-7]，作為相應(yīng)適應(yīng)癥的用藥指導(dǎo)。不同試劑盒所用抗體、檢測(cè)平臺(tái)、評(píng)價(jià)方法以及相應(yīng)的陽(yáng)性閾值均不同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果存在一定差異[8-11]。相較于國(guó)際市場(chǎng)，國(guó)內(nèi)目前僅有3款進(jìn)口PD-L1檢測(cè)試劑盒獲得國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)[12-13]。本研究自主開(kāi)發(fā)了PD-L1(WD160)診斷試劑盒，通過(guò)與獲批的PD-L1(22C3)試劑盒在CC組織樣本中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色比較，探究?jī)煞N診斷試劑結(jié)果的一致性，并檢測(cè)PD-L1在CC不同階段的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 抗PD-L1單克隆抗體的制備抗PD-L1單克隆抗體制備的詳細(xì)信息參見(jiàn)中國(guó)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)：CN109627338A；專(zhuān)利公布日：2019年4月16日)。以人PD-L1蛋白片段作為抗原，采用皮下注射方法免疫BALB/c小鼠，免疫2次后取血以梯度稀釋ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)。選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選，獲得單克隆細(xì)胞株WD160。通過(guò)WD160細(xì)胞上清液的制備和純化，得到抗PD-L1單克隆抗體。在完成PD-L1(WD160)抗體的免疫組化驗(yàn)證后，從雜交瘤細(xì)胞中分離總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)特異性引物擴(kuò)增VH、VL、CH和CL抗體片段，分別克隆至標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2 臨床研究對(duì)象收集2019年5月—2020年7月于河南省腫瘤醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院和中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(浙江省腫瘤醫(yī)院)就診的有明確病理診斷的1 010例CC患者樣本。除納入臨床上經(jīng)H-E染色病理診斷為CC的石蠟包埋組織樣本，以宮頸良性疾病41例及除CC以外腫瘤患者51例的石蠟包埋組織樣本(取自同樣3家醫(yī)院)作為對(duì)照樣本。排除采樣量不足，無(wú)法溯源或被污染的樣本。本研究已獲得3家醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 試劑與儀器抗PD-L1抗體試劑(克隆號(hào)WD160)和DAB染色液試劑盒，購(gòu)自蘇州藥明澤康生物科技有限公司。使用方法參見(jiàn)其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。操作流程簡(jiǎn)述：樣本于60～65 ℃烤片1～2 h，脫蠟水化后，高壓修復(fù)3 min，3%過(guò)氧化氫處理10 min；抗人PD-L1抗體(一抗)孵育30 min，用二抗試劑盒中免疫顯色試劑1孵育10 min，免疫顯色試劑2孵育30 min；DAB顯色3～5 min，DAB增強(qiáng)劑處理8 min，蘇木素襯染后進(jìn)行脫水、透明、封片。以PD-L1檢測(cè)試劑盒為對(duì)比試劑(PD-L1 IHC 22C3 pharmDx)(購(gòu)自美國(guó)丹科北美有限公司)。在該公司配套的AutoStainer Link 48全自動(dòng)免疫組化染色儀上染色。

1.4 研究方法本研究共納入1 102例臨床診斷為CC的手術(shù)或活檢患者、宮頸良性疾病及其他腫瘤(如舌鱗癌、乳腺癌、鼻咽癌等)患者，調(diào)取其經(jīng)診斷后剩余的石蠟包埋組織樣本，連續(xù)切片，分別用WD160和22C3染色。CC組織中PD-L1染色細(xì)胞的閱片標(biāo)準(zhǔn)如下[14]。

1.4.1 判讀標(biāo)準(zhǔn) 由具備相應(yīng)專(zhuān)業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格的兩位病理醫(yī)師分別于顯微鏡下觀察染色切片，判斷染色定位，并通過(guò)計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)，按照公式聯(lián)合陽(yáng)性分?jǐn)?shù)(combined positive score， CPS)=[PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(腫瘤細(xì)胞+免疫細(xì)胞)/可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)]×100進(jìn)行組織學(xué)分析，判讀PD-L1的表達(dá)情況。染色評(píng)估需在低倍、高倍鏡下觀察進(jìn)行。樣本中的活/可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)不少于100個(gè)。以CPS=1作為陽(yáng)性判斷值，CPS≥1為陽(yáng)性，CPS<1為陰性。

1.4.2 CC組織PD-L1表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)分子納入/排除標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，公式中分子的計(jì)數(shù)范圍為PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞。其中任何染色強(qiáng)度的浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞和完整或不完整的膜染色腫瘤細(xì)胞應(yīng)納入計(jì)數(shù)，未被染色的腫瘤細(xì)胞以及只有細(xì)胞質(zhì)染色的腫瘤細(xì)胞不納入計(jì)數(shù)。癌巢內(nèi)以及相鄰基質(zhì)內(nèi)任何強(qiáng)度膜/質(zhì)染色的單核炎癥細(xì)胞(mononuclear inflammatory cell， MIC)、淋巴細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞簇)和巨噬細(xì)胞納入計(jì)數(shù)，未被染色的MIC、與宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia， CIN)相關(guān)的MIC、與包括鱗狀上皮或腺黏膜、宮頸息肉和微腺體增生在內(nèi)的良性細(xì)胞相關(guān)的MIC、與潰瘍有關(guān)的MIC以及與腫瘤無(wú)關(guān)的其他病理過(guò)程中的MIC均排除于計(jì)數(shù)外。

1.4.3 CC組織PD-L1表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)分母納入/排除標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，公式中分母的計(jì)數(shù)范圍為可計(jì)數(shù)的腫瘤細(xì)胞總數(shù)，即所有活的腫瘤細(xì)胞均納入計(jì)數(shù)，而壞死腫瘤細(xì)胞、所有種類(lèi)的免疫細(xì)胞和CINⅠ～Ⅲ、良性細(xì)胞(包括鱗狀上皮或腺黏膜、宮頸息肉和微腺體增生)、基質(zhì)細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞)均予以排除。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，繪制2×2矩陣計(jì)算兩種試劑的符合率，用Kappa檢驗(yàn)計(jì)算兩種試劑的檢測(cè)一致性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 抗PD-L1抗體(WD160)的性能驗(yàn)證以人PD-L1蛋白片段為抗原免疫小鼠，制備抗PD-L1單克隆抗體(WD160)。通過(guò)ELISA鑒定抗體的亞型，結(jié)果顯示W(wǎng)D160的抗體亞型為IgG1型。同時(shí)，抗體親和力檢測(cè)結(jié)果顯示，在多肽摩爾濃度為0.82 μmol/L時(shí)，WD160的親和力常數(shù)為6×10-7(mol/L)。用WD160進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)PD-L1在組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，在扁桃體質(zhì)控組織中，PD-L1在隱窩上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，在生發(fā)中心呈弱至中等強(qiáng)度的陽(yáng)性染色，與相同濃度的參比PD-L1抗體丹科22C3結(jié)果一致(圖1A)。同時(shí)，在肺癌組織中，無(wú)論是強(qiáng)度還是定位，WD160與22C3的染色效果都非常一致(圖1B)。

注：A. 扁桃體組織的PD-L1染色；B. 肺癌組織的PD-L1染色。

2.2 目標(biāo)人群臨床基本特征的描述篩選臨床上確診為CC的患者為主要研究人群，其臨床表現(xiàn)有白帶異常、陰道出血、腰痛、下肢疼痛、貧血和發(fā)熱等。CC的輔助檢查方法有HPV檢測(cè)、組織學(xué)檢查、陰道鏡檢查、影像學(xué)檢查及腫瘤標(biāo)志物檢查等，目前該病確診的金標(biāo)準(zhǔn)為陰道鏡或直視下的宮頸活檢病理檢查。

研究共納入1 102例患者，年齡(51.88±11.38) 歲， 手術(shù)獲取樣本883例， 活檢樣本219例， 其中CC患者1 010例(鱗狀細(xì)胞癌788例、腺癌153例、鱗腺癌12例及其他類(lèi)型CC患者57例)，宮頸良性疾病患者41例和其他類(lèi)型腫瘤患者51例(表1)。

表1 研究對(duì)象基本病理特征

2.3 PD-L1在CC組織中的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，PD-L1染色陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，主要表達(dá)于CC細(xì)胞以及腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞。PD-L1在CC腫瘤細(xì)胞中染色以膜染色為主，全膜染色或半膜染色均可納入計(jì)數(shù)(圖2A)；腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞指的是20倍同框下，浸潤(rùn)的腫瘤細(xì)胞周?chē)旧?yáng)性的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞(圖2B)。

注：A. 腫瘤細(xì)胞的PD-L1染色；B. 腫瘤細(xì)胞周?chē)庖呒?xì)胞的PD-L1染色。

根據(jù)CC中PD-L1的閱片標(biāo)準(zhǔn)，1 010例CC患者中，因不符合閱片標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法判讀的樣本為61例；在可統(tǒng)計(jì)的949例CC樣本中，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)(CPS≥1)的樣本共有773例，陽(yáng)性率為81.5%; 在PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的組織樣本中，CPS不同分層的樣本分布較為均勻(表2)。

表2 PD-L1表達(dá)水平在不同CC樣本中的分布

2.4 WD160與22C3的符合率對(duì)可統(tǒng)計(jì)的949例CC樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，WD160與22C3試劑的陽(yáng)性符合率為100.00%，陰性符合率為83.81%，總符合率為96.42%; 使用Kappa檢驗(yàn)對(duì)兩種試劑的一致性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，K=0.889 6，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05， 表3)。

表3 WD160和22C3的符合率計(jì)算的2×2矩陣

2.5 PD-L1分子在不同分期腫瘤組織中的表達(dá)差異共納入浙江省腫瘤醫(yī)院215例CC患者參與本次統(tǒng)計(jì)分析，因?yàn)楦鞣N原因(患者有信息不全、有治療史、CC樣本腫瘤細(xì)胞數(shù)少于100個(gè)等)有45例樣本被剔除。根據(jù)CC國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(International Federation of Gynecology and Obstetrics， FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)，合格的170例樣本的腫瘤分期情況如下(表4)。

表4 不同分期CC患者的PD-L1表達(dá)情況

對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期共163例PD-L1陽(yáng)性患者的CPS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示臨床Ⅰ期和Ⅱ期患者的CPS很接近，中位數(shù)分別為60和55，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.57)。而相對(duì)地，臨床Ⅲ期患者的CPS顯著降低，中位數(shù)為35，與另兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005，P=0.03，P總=0.015)。由于Ⅳ期只有2例患者，故沒(méi)有納入統(tǒng)計(jì)分析。(圖3)

注：PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞(WD160染色)在不同分期腫瘤組織(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)中的CPS統(tǒng)計(jì)箱線(xiàn)圖。Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)示3組間的P總值為0.015。

3 討論

PD-L1作為免疫治療藥物的靶點(diǎn)，其表達(dá)水平對(duì)篩選免疫治療獲益人群至關(guān)重要。國(guó)際上PD-L1檢測(cè)試劑盒有4種，克隆號(hào)分別為22C3、28-8、SP263和SP142。目前還沒(méi)有國(guó)產(chǎn)的PD-L1伴隨診斷試劑盒應(yīng)用于臨床診斷。WD160的研發(fā)將有助于填補(bǔ)這一空白。值得一提的是，北京301醫(yī)院韓為東教授在針對(duì)霍奇金淋巴瘤患者PD-1抗體聯(lián)合用藥研究的臨床試驗(yàn)中，使用WD160試劑盒評(píng)估腫瘤樣本的PD-L1表達(dá)水平，作為臨床用藥的參考指標(biāo)，結(jié)果表明PD-L1高表達(dá)的患者PD-1抗體聯(lián)合用藥的效果優(yōu)于單獨(dú)化療[15]。

本研究針對(duì)CC患者，以抗PD-L1(22C3)抗體試劑盒為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)蘇州藥明澤康生物科技有限公司的抗PD-L1(WD160)抗體檢測(cè)質(zhì)量。使用這兩種試劑進(jìn)行CC組織樣本的PD-L1免疫組織化學(xué)染色，并由專(zhuān)業(yè)的病理醫(yī)師判讀結(jié)果。兩種試劑的判讀標(biāo)準(zhǔn)及截止值一致，染色模式也相似，均表現(xiàn)為細(xì)胞膜染色。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，兩種試劑的陽(yáng)性符合率為100.00%，陰性符合率為83.81%，總符合率為96.42%，K值為0.889 6且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明兩種試劑的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。KEYNOTE158(NCT02628067)臨床試驗(yàn)中，共納入98例CC患者，其中82例為PD-L1表達(dá)陽(yáng)性，即陽(yáng)性率達(dá)83.7%[16]。一項(xiàng)僅針對(duì)中國(guó)CC人群的研究也表明，PD-L1在CC中高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率可達(dá)81.30%[17]。本研究納入的、可判讀的949例CC患者的PD-L1陽(yáng)性率達(dá)81.50%(表2)，說(shuō)明PD-L1試劑(WD160)可有效識(shí)別CC中相應(yīng)陽(yáng)性人群。PD-L1(WD160)與PD-L1(22C3)的陰性符合率為83.81%。分析染色結(jié)果不一致的34例樣本，抗體染色強(qiáng)度不同為主要原因。

PD-L1的高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤局部微環(huán)境免疫監(jiān)視功能下降，促使腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。因此，PD-L1的表達(dá)水平對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后改善都有著重要影響。在非小細(xì)胞肺癌組織中PD-L1的表達(dá)水平與免疫治療效果正相關(guān)，PD-L1高表達(dá)已成為免疫治療中單藥治療的新標(biāo)準(zhǔn)[18]。本研究對(duì)170例不同腫瘤分期患者的PD-L1陽(yáng)性分布進(jìn)行了初步評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ、Ⅱ期患者的PD-L1陽(yáng)性率沒(méi)有差別，而Ⅲ期患者的PD-L1陽(yáng)性程度顯著降低(P總=0.015)。此結(jié)果與非小細(xì)胞肺癌中報(bào)道的結(jié)果存在差異，這可能與腫瘤類(lèi)型不同有關(guān)。但需要指出的是，在肺癌組織的PD-L1染色情況判讀中，只考慮了腫瘤細(xì)胞的PD-L1染色，而在CC中，PD-L1的判讀標(biāo)準(zhǔn)是不但要納入腫瘤細(xì)胞的表達(dá)情況，還要考慮到腫瘤細(xì)胞周?chē)庖呒?xì)胞中PD-L1的表達(dá)水平，也就是整個(gè)腫瘤微環(huán)境中PD-L1的表達(dá)。究竟腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)還是腫瘤微環(huán)境的PD-L1表達(dá)與腫瘤免疫治療更相關(guān)，這是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。PD-L1抗體藥物已被用于晚期CC患者的治療[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)在不同分期的CC中有差異，這種差異是否對(duì)CC患者的用藥有指導(dǎo)意義，還需要進(jìn)一步的臨床研究。

綜上所述，PD-L1(WD160)與PD-L1(22C3)的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性，可進(jìn)一步作為CC免疫治療藥物的伴隨診斷試劑，有助于藥物療效相關(guān)性和有效性的臨床研究工作開(kāi)展。