孫克娜，陳英劍，宋御繁，劉曉斐

(1.濰坊醫(yī)學院 醫(yī)學檢驗學院，濰坊 261053；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院 檢驗科，濟南 250031)

2018年全球癌癥調查研究報告顯示，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率居第3位，病死率居第2位，發(fā)展中國家CRC發(fā)病率比發(fā)達國家高3倍[1]。我國是CRC發(fā)病的高危國家，但目前CRC的發(fā)病機制尚不完全明確，也無特異的早期診斷和治療方法[2]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)具有重要的抗腫瘤作用，機體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用以T細胞及其亞群介導的細胞免疫為主[3]。然而，機體抗腫瘤作用的實現(xiàn)依賴于T細胞功能的正常發(fā)揮，免疫抑制可促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。雙陰性T細胞(double-negative T cell，DNT)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種Treg，其表面既不表達CD4抗原也不表達CD8抗原。DNT占正常人外周血總淋巴細胞的1%～5%[5]，在CRC患者中的表達規(guī)律尚無統(tǒng)一的結論。目前，DNT抗腫瘤作用成為研究的熱點。本研究擬以健康人為對照，通過FACS檢測術前、術后及不同臨床分期CRC患者的T細胞亞群及DNT分布情況，分析CRC患者及其術后細胞免疫功能狀況，探討相關的作用及免疫機制，旨在為臨床CRC的診斷和治療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年6月—2019年11月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院確診的93例CRC患者為CRC組，其中男性50例、女性43例，年齡(61.2±11.2)歲?；颊咧?，結腸腫瘤40例、直腸腫瘤53例；病理類型：腺癌73例、黏液腺癌+印戒細胞癌20例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期61例、Ⅲ+Ⅳ期32例。另選取54例同期健康體檢者作為健康組，其中男性29例、女性25例，年齡(60.7±13.4)歲。2組研究對象性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。樣本按統(tǒng)一流程進行篩選(圖1)。同時，將93例CRC患者按臨床分期分為2組，即Ⅰ+Ⅱ期組、Ⅲ+Ⅳ期組，2組基線資料差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 樣本篩選流程

1.2 試劑與儀器CD45-FITC/CD4-藻紅蛋白(phycoeryth，PE)/CD8-藻紅蛋白-德克薩斯紅(phycoerythrin Texas red，ECD)/CD3-藻紅蛋白藕聯(lián)物(phycoerythrin coupling compound 5，PC5)和FC500流式細胞儀均購自貝克曼-庫爾特公司。

1.3 方法采集健康者和CRC患者術前及術后第7天的空腹靜脈血2 mL，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，在樣本采集完成后6 h內檢測。按照檢測要求，向流式試管內分別加入10 μL單克隆抗體，隨即加入100 μL抗凝血，振蕩混勻，室溫下避光孵育20 min，加入溶血劑溶解紅細胞后，按照操作程序上機檢測。檢測時以CD45 /SSC 和 CD3 /SSC 圈定淋巴細胞和T細胞，每次檢測前均用Flow Check對儀器流路、光路進行校準。

2 結果

2.1 CRC患者外周血T細胞亞群及DNT比例的FACS分析采用FACS分析CRC患者和健康者外周血T細胞亞群及DNT比例。結果顯示，與健康組比較，CRC組CD3+T細胞和CD3+CD4+T細胞比例顯著降低(P<0.05)，DNT比例顯著升高(P<0.05)，CD3+CD8+T細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但有升高的趨勢。(圖2、表1)

注：A～D.分別為CRC組CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和DNT FACS散點圖；E～H.分別為健康組CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和DNT FACS散點圖。

表1 CRC組和健康組外周血T細胞亞群及DNT的分布

2.2 CRC患者手術前后外周血T細胞亞群及DNT的FACS分析為初步明確手術治療后CRC患者外周血T細胞亞群及DNT比例的變化，采用FACS進行分析。結果顯示，與術前比較，CRC患者術后CD3+CD4+T細胞比例顯著升高(P<0.05)，DNT比例顯著降低 (P<0.05)。(圖3、表2)

表2 CRC患者手術前后T細胞亞群及DNT的分布

注：A～D.分別為CRC患者手術前CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和DNT FACS散點圖；E～H.分別為CRC患者手術后CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和DNT FACS散點圖。

2.3 不同臨床分期CRC患者外周血T細胞亞群及DNT的FACS分析為比較Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期CRC患者外周血T細胞亞群及DNT的分布差異，采用FACS進行分析。結果顯示，與Ⅰ+Ⅱ期CRC組比較，Ⅲ+Ⅳ期CRC組DNT比例顯著降低(P<0.05)(表3)。Ⅲ+Ⅳ期患者DNT雖顯著降低，但與健康組比較表達水平仍升高(Z=5.72，P<0.05)。

表3 Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期CRC患者T細胞亞群及DNT的分布

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫狀態(tài)密切相關，惡性腫瘤患者免疫功能低下，腫瘤細胞容易增殖[5]。T細胞亞群的數(shù)量和比例是評價機體免疫狀態(tài)的重要指標[6]。T細胞亞群的比例失衡和功能異常，可導致機體免疫紊亂并誘發(fā)一系列病理變化，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，基于分化抗原分子的不同，CD3+T總淋巴細胞大體可劃分為CD4+和CD8+T細胞2個亞群[8]。CD4+T細胞為輔助性 T細胞，在細胞因子和抗原等的刺激下，進一步分化為Th2、Th17、濾泡輔助性T細胞、Treg、Th9和Th22，輔助機體完成抗腫瘤免疫[9]。CD8+T細胞可分為抑制性T細胞和CTL：一方面，CD8+T細胞通過自身抑制因子在免疫反應中發(fā)揮作用，使CD4+T細胞和B細胞功能受到抑制，從而抑制細胞免疫反應及體液免疫反應；另一方面，CD8+T細胞可通過顆粒酶/穿孔素等多種途徑對突變細胞或腫瘤細胞進行特異性殺傷[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，腸癌患者外周血CD3+和CD4+T細胞的比例明顯下調，CD8+T細胞比例上調[11]，這與本研究結果相似，說明CRC患者處于免疫抑制狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC患者術后CD3+CD4+T細胞比例較術前明顯升高，提示CD4+T細胞輔助參與的體液免疫相對增強。目前，隨著T細胞亞群研究機制的不斷深入，腫瘤免疫指標的檢測和免疫治療方案的制定越來越受到臨床關注。腸鏡病理檢查對患者和醫(yī)師要求較高，可能會出現(xiàn)穿孔、出血等不良反應，無法成為大規(guī)模使用的初篩工具。通過監(jiān)測CRC患者T細胞亞群的表達，可進一步評估患者的抗腫瘤免疫功能，進而為判斷患者預后及設計更為切實可行的治療方案提供理論依據，該方法簡便易行，有望今后在基層醫(yī)院得到深入開展。

研究發(fā)現(xiàn)，在B16F10小鼠黑色素瘤模型中，DNT可抑制CD4+T細胞的殺傷功能，減少腫瘤組織中淋巴細胞浸潤從而促進腫瘤生長，且小鼠體內DNT數(shù)量與腫瘤大小呈正相關[12-13]，說明DNT有促進腫瘤生長的作用。另外，在研究DNT的腫瘤免疫治療中發(fā)現(xiàn)，DNT對腫瘤細胞具有殺傷作用：(1)通過Fas/FasL途徑誘導腫瘤細胞凋亡[14]；(2)通過顆粒酶/穿孔素途經殺傷腫瘤細胞[15]；(3)通過分泌細胞因子(如TNF-α、IFN-γ、IL-17和顆粒酶B)作用于腫瘤細胞[16]。(4)通過NK細胞活化性受體及其配體MHCⅠ類相關基因A途徑直接殺傷腫瘤細胞[17-18]；(5)通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及其受體途徑抑制腫瘤細胞增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組患者DNT比例顯著高于健康組，并且Ⅲ+Ⅳ期CRC患者 DNT比例較Ⅰ+Ⅱ期患者明顯降低。這些結果提示，DNT在CRC中可能發(fā)揮正向的殺傷腫瘤作用?；颊呤中g后DNT比例顯著降低，表明在CRC的發(fā)生和發(fā)展過程中可能存在DNT的調節(jié)紊亂或異常表達。

DNT作為一種獨特的調節(jié)性細胞群，具有免疫抑制功能，可以選擇性地抑制CD4+T細胞的mTOR信號轉導，從而抑制CD4+T細胞的增殖和功能，其被稱作“天生的抑制器”[20]。研究發(fā)現(xiàn)，OX40在CRC腸系膜淋巴結等部位高表達，并且能夠調控CD4+T細胞向DNT轉化，提高DNT的轉化效率，并且抑制DNT凋亡[21-22]。這可能是CRC患者DNT升高而CD4+T細胞下降的原因。DNT的具體作用機制尚不完全明確，DNT是否還通過其他的途徑對腫瘤細胞發(fā)揮作用，尚需進一步研究。同時，臨床分期是決定CRC治療效果和預后的重要依據，但傳統(tǒng)診斷技術在CRC臨床分期過程中可能存在主觀因素的影響。如果能通過分子免疫學方法加以輔助分期，可能對CRC治療和預后的準確判斷更有意義。

綜上所述，本研究證實了CRC患者存在細胞免疫功能紊亂及DNT高表達，而在晚期患者中出現(xiàn)DNT表達降低，這些結果為DNT在腫瘤免疫中的作用研究提供了一定的科學依據。CRC患者外周血T細胞及DNT檢測有望成為評估術前機體免疫狀態(tài)、手術預后及治療效果的指標，為CRC的診斷、臨床分期及制定免疫治療策略提供新的思路和理論依據。