方均燕，宋阿會，劉英莉

(上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，上海 200011)

膿毒癥為機體對感染反應失調(diào)的臨床綜合征，臨床上缺乏有效的治療方法[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，瀑布式炎癥級聯(lián)反應是膿毒癥發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[3]。作為機體反應的第1道防線，巨噬細胞可極化為促炎型(M1型)或免疫調(diào)節(jié)型(M2型)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制巨噬細胞M1型極化，能夠提高膿毒癥小鼠的生存率[5]。因此，調(diào)控巨噬細胞極化有望成為膿毒癥治療的新方向。大電導鈣依賴性鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel，BKca)分布于多種類型細胞膜上[6]。研究發(fā)現(xiàn)，BKca不僅能夠維持鉀離子平衡，而且參與調(diào)節(jié)多種炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展[7-8]，有望成為炎癥治療的靶點。本研究以BKca為研究對象，探討其對巨噬細胞的增殖、M2/M1亞型極化及細胞因子分泌水平的影響，以期為膿毒癥的免疫治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材人單核細胞系THP-1 (中國科學院細胞庫)，RPMI 1640培養(yǎng)液(Hyclone公司)，F(xiàn)BS(Bioind公司)，青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，CCK-8(上海睿安生物科技有限公司)，F(xiàn)ITC標記的人CD80抗體(FITC-CD80)、別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記的人CD206抗體(APC-CD206)試劑盒(BioLegend公司)，PBS溶液(Hyclone公司)，Hank＇s溶液(Gibco公司)，蕈青霉素(Alomone公司)，佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；Sigma公司)，電轉液、電泳液[生工生物工程(上海)股份有限公司]，BKcα抗體(Alomone公司)，GAPDH抗體(Proteintech公司)，RIPA(碧云天有限公司)，蛋白磷酸酶抑制劑混合物(索萊寶公司)，RT reagent Kit(TaKaRa公司)。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計、合成(表1)。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 THP-1 細胞的預處理 將THP-1細胞加入含10% FBS及1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放入37 °C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。取無菌細胞培養(yǎng)6孔板，收集培養(yǎng)的細胞進行細胞計數(shù)，調(diào)整密度為1×106個/mL，加入含有100 nmol/L PMA的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS清洗2次，再加入不同處理因素。

1.2.2 細胞活性的CCK-8檢測 將THP-1細胞以104個/孔的密度接種至96孔板，待其長至80%融合時加入不同濃度的蕈青霉素(0、0.01、0.1、0.5和1 μmol/L )孵育24 h，各孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育4 h，用微孔酶標儀檢測各孔光密度[D(450 nm)]值，用Graphpad 5軟件分析各組差異。

1.2.3 BKca蛋白表達的Western blotting 檢測 將細胞預處理后，加入不同濃度LPS(0、10、100、500和1 000 ng/mL)以及蕈青霉素孵育24 h，去除上清液，加入RIPA和蛋白磷酸酶抑制劑混合物配置的裂解液裂解細胞，用BCA法定量各組蛋白濃度后，加入適量5×上樣緩沖液，以100 ℃煮10 min。配制8%的SDS-PAGE膠，將不同處理組巨噬細胞所提取的蛋白樣品在上樣前以100 ℃煮5 min，以80 V恒壓電泳至染料前沿達凝膠底部，220 mA恒流轉膜2 h，膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入一抗，4 ℃過夜孵育8～16 h，TBST洗3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次后顯色。用Image J軟件分析灰度值。

1.2.4 M1/M2型巨噬細胞的FACS檢測 將細胞預處理后分為3組：對照組、LPS組(LPS 100 ng/mL)及LPS+蕈青霉素組(LPS 100 ng/mL、蕈青霉素100 μmol/L)。用0.25%胰蛋白酶消化各孔細胞，取一組空白組作空白對照，其余孔細胞被消化后以208×g離心5 min，棄上清液。以PBS洗滌后用FITC-CD80、APC-CD206熒光一抗進行染色，分別作為巨噬細胞共同表面標志和M1、M2型巨噬細胞特異性標志。以上操作均在冰上完成。使用FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences公司)進行檢測，并用CytExpert軟件分析檢測結果。

1.2.5 巨噬細胞RNA的提取與qRT-PCR檢測 將細胞預處理后分為3組：對照組、LPS組(LPS 100 ng/mL)及LPS+蕈青霉素組(LPS 100 ng/mL、蕈青霉素100 μmol/L)。按照TaKaRa總RNA制備試劑盒說明書所述步驟從洗滌好的上述巨噬細胞中提取總RNA，使用微量核酸儀(NanoDrop Technologies公司)檢測波長在260及280 nm處的吸收峰并測定濃度，將100 ng RNA按照反轉錄試劑盒說明書方法反轉錄得到cDNA，并保存在-80 ℃中。

用SYBR Green Master Mix擴增上述cDNA并分析其對應的mRNA表達，以GAPDHRNA為內(nèi)參，GAPDH引物為商品化的人內(nèi)參基因GAPDH引物。所有樣品均設3個復孔。

2 結果

2.1 不同濃度蕈青霉素對THP-1細胞來源的巨噬細胞活性的影響用不同濃度BKca抑制劑蕈青霉素(0、0.01、0.1、0.5和1 μmol/L)處理THP-1細胞 24 h，用CCK-8檢測各組D(450 nm)值。結果顯示，低濃度的BKca抑制劑蕈青霉素對細胞活性沒有明顯影響，而高濃度蕈青霉素(1 μmol/L)能夠顯著降低細胞活性(P<0.05)。(圖1)

注：與蕈青霉素0 μmol/L組比較，*P<0.05。

2.2 不同濃度LPS對THP-1細胞來源巨噬細胞BKca蛋白表達的影響用不同濃度LPS(0、10、100、500和1 000 ng/mL)處理THP-1細胞來源的巨噬細胞24 h，提取蛋白質(zhì)進行Western blotting檢測，以GAPDH為內(nèi)參，可檢測到BKca蛋白的表達；且隨著LPS濃度的增加，巨噬細胞的BKca蛋白表達量也相應增加(P<0.01)。(圖2)

注：與LPS 0 ng/mL組比較，**P<0.01；與LPS 100 ng/mL組比較，#P<0.05。

2.3 蕈青霉素對LPS刺激THP-1細胞來源巨噬細胞BKca蛋白表達的影響將細胞預處理后分為4組：對照組、LPS組(LPS 100 ng/mL)、蕈青霉素組(蕈青霉素100 μmol/L)及LPS+蕈青霉素組(LPS 100 ng/mL、蕈青霉素100 μmol/L)，提取蛋白質(zhì)進行Western blotting檢測，以GAPDH為內(nèi)參，可檢測到BKca蛋白的表達。與對照組比較，LPS刺激后巨噬細胞上BKca蛋白表達量增加(P<0.05)，加入蕈青霉素后，其表達量有所降低(P<0.01)。(圖3)

注：與對照組比較，*P<0.05；與LPS組比較，##P<0.01。

2.4 蕈青霉素對LPS誘導THP-1細胞來源巨噬細胞極化的影響FACS結果顯示，相對于對照組，LPS刺激誘導巨噬細胞后，M2/M1比例降低，以M1型細胞為主(P<0.01)；而加入蕈青霉素后，M2/M1比例增加，以M2型細胞為主(P<0.01)。(圖4)

注：A～C.分別為FACS檢測對照組、LPS組、LPS+蕈青霉素組THP-1細胞中巨噬細胞亞型分化；D.上述A、B、C圖各組巨噬細胞M2/M1比例的統(tǒng)計分析。與對照組比較，**P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01。

2.5 蕈青霉素 對LPS刺激THP-1細胞來源巨噬細胞分泌炎性因子的影響qRT-PCR結果顯示，LPS刺激巨噬細胞后，細胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05)。在蕈青霉素干預后，巨噬細胞表達的促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1βmRNA水平明顯低于LPS組，而抑炎因子IL-10 mRNA水平明顯高于LPS組(P<0.05)。(圖5)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05。

3 討論

在生理狀態(tài)下，BKca作為一種鉀離子通道，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)鉀離子平衡、神經(jīng)遞質(zhì)釋放及維持血壓等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制BKca活性能夠抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞、前列腺癌細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞等的增殖。本研究也證實了BKca特異性抑制劑對THP-1細胞增殖具有抑制作用。

BKca在炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到至關重要的作用。BKca與TLR2相結合，可促進炎性因子的釋放，應用BKca抑制劑能有效阻止炎性因子的釋放[9]。在類風濕關節(jié)炎的動物模型中，應用BKca抑制劑可通過影響T細胞和關節(jié)滑膜細胞的相互作用減輕關節(jié)炎癥的程度[10]。Ren等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺炎小鼠模型中抑制BKca能夠減輕巨噬細胞的炎癥反應。本研究在人單核細胞上也證實了LPS能夠激活BKca蛋白的表達，提示BKca可能參與了LPS介導的THP-1細胞的炎癥反應。而Martin等[12]研究證實，Th2相關的細胞因子IL-4可以激活氣道平滑肌細胞上的BKca，在實驗性的哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)應用BKca激動劑可以通過激活BKca減輕哮喘癥狀。以上研究表明，BKca在不同炎癥反應中的作用并不一致。

在膿毒癥小鼠模型中，異橙皮內(nèi)酯通過下調(diào)NF-κB胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路來抑制M1型極化，提高小鼠的存活率，緩解炎癥反應[5]。Tang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲(schistosoma japonicum，SJ)感染可觸發(fā)巨噬細胞向M2型極化，上調(diào)抑炎因子IL-10水平，逆轉LPS誘導M1型巨噬細胞的極化，降低促炎因子TNF-α水平，進一步將M2型巨噬細胞轉移至膿毒癥小鼠體內(nèi)，可提高小鼠的存活率。以上研究表明，在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中，LPS介導的巨噬細胞分泌的炎性因子可導致組織細胞的損傷，M2/M1比例能夠影響炎癥反應的結局。Papavlassopoulos等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BKca參與了巨噬細胞識別LPS的早期過程。本研究采用LPS體外刺激模擬膿毒癥早期的急性炎癥，誘導THP-1細胞來源巨噬細胞向M1型極化，可見炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6大量釋放；應用BKca特異性抑制劑誘導巨噬細胞向M2型極化，減輕了瀑布樣炎性因子的釋放。

既往研究和本研究均發(fā)現(xiàn)，BKca可能參與了巨噬細胞活化的起始階段，具體機制尚不明確。BKca抑制劑逆轉LPS刺激下巨噬細胞分泌的炎性因子水平，其可能是通過抑制IκB-α/NF-κB信號通路來實現(xiàn)的[14]。另外，鉀離子的外流是NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3, NLRP3)炎癥小體激活的必要條件[15]，炎癥小體激活后使pro-Caspase-1轉化為活化的Caspase-1，可裂解pro-IL-1β，最終導致促炎因子IL-1β的成熟和釋放。BKca作為一種鉀離子通道，被阻斷后可抑制Caspase-1活性[14]。然而，這一機制是否通過影響NLRP3炎癥小體激活來介導，尚需進一步研究闡明。

本研究證實，BKca參與了LPS誘導下巨噬細胞的早期活化，調(diào)控M2/M1巨噬細胞亞型平衡以及炎性因子的釋放，抑制BKca能夠減輕LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應。以BKca為靶點，從上游調(diào)控這種瀑布樣的炎癥效應，可為膿毒癥免疫治療提供一種新的策略和重要的理論依據(jù)，這有望降低膿毒癥患者的病死率。然而，本研究尚存在一定的局限性：首先，本研究未檢測細胞內(nèi)外鉀離子和鈣離子的水平，不能驗證其離子轉運功能在此過程中發(fā)揮何種作用；其次，BKca參與巨噬細胞極化的具體調(diào)控機制及相關信號轉導通路仍需研究明確；最后，BKca在膿毒癥小鼠中的作用及分子機制需要進一步研究闡明。