阿布都艾尼·熱吾提 肖偉 周文正 車立新 徐江波 孫俊剛

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA) 是一種常見的慢性退行性關節(jié)疾病，其特征是關節(jié)軟骨、滑膜與軟骨下骨的炎癥改變[1-2]。OA 的病因十分復雜，包括關節(jié)損傷、遺傳、肥胖、衰老和炎癥等，其確切的發(fā)病機制仍不十分清楚[3]。軟骨細胞是關節(jié)軟骨中的特有細胞，合成由 Ⅱ 型膠原蛋白和蛋白聚糖組成的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，并且在維持 ECM 代謝和分解之間的動態(tài)平衡方面起著關鍵作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞的增殖與凋亡異常均與 OA 發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。微小 RNA(microRNA，miRNA) 是一類小、非編碼 RNA 分子，長度約 20～22 個核苷酸，通過與 3’-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR) 相互作用來調節(jié)轉錄后水平的基因表達[6]。隨著越來越多的 miRNA 被發(fā)現(xiàn)，其在 OA 中的生物學功能受到極大的關注，并可能成為 OA 新的診斷標志物和分子治療靶點[7]。miR-145 是當前研究最多的 miRNA 之一，其在生物發(fā)育、腫瘤形成及炎癥反應中均具有重要作用[8-10]。研究顯示，miR-145 對于維持血管平滑肌細胞的分化狀態(tài)和調節(jié)胚胎干細胞的自我更新十分重要[11]。此外，miRNA 表達譜芯片數(shù)據(jù)表明，miR-145 在 OA 軟骨細胞中的表達水平明顯下調[12]。目前關于 miR-145 在 OA 中的生物學作用尚不清楚。本研究通過建立不同濃度腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) 誘導人關節(jié)軟骨細胞模型，觀察 miR-145 對細胞增殖、凋亡及炎癥反應的影響，旨在為 OA 防治提供新的方向與思路。

材料與方法

一、方法

1.細胞培養(yǎng)：人關節(jié)軟骨細胞系(C-20 / A4 和 CH8) 購自中科院上海細胞庫。所有細胞均放置于 37 ℃ 含 5% CO2的細胞培養(yǎng)箱(Bio-Rad 公司，美國) 中培養(yǎng)，給予充足的杜氏改良 eagle 培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)，并添加10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 U / ml 青霉素和 100 μg / ml 鏈霉素(Sigma，美國)。

2.TNF-α 誘導軟骨細胞：選取生長狀態(tài)良好的 C-20 / A4 和 CH8 細胞按照 7×106個 / 孔接種至 6 孔板，培養(yǎng)過夜后，分別將 0、5、10、15 及 30 ng / ml TNF-α(Thermo Fisher Scientific 公司，美國) 添加至各孔細胞中，每組設置 2 個復孔，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，之后按照要求收集細胞進行炎癥因子濃度檢測。

3.細胞轉染：取 30 ng / ml TNF-α 誘導的 C-20 / A4 和 CH8 細胞按照 3×104個 / 孔接種至 24 孔板，培養(yǎng)過夜后，待融合度達到 80% 時采用 lipofectamine 2000 試劑(Thermo Fisher Scientific 公司，美國) 轉染 miR-145 模擬物(mimics) 及模擬物對照(mimics control)(蘇州吉瑪基因股份有限公司) 至各孔細胞中，每組設置 2 個復孔，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中孵育 48 h，之后收集細胞檢測轉染效率。

4.噻唑藍比色法 [ 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT ]：取轉染后的 C-20 / A4 和 CH8 細胞按照 5×103個 / 孔接種至 96 孔板，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0、24、48 和 72 h 后，向每個孔中添加 12 μl MTT(5 mg / ml)，繼續(xù)孵育 3～4 h 后去上清，每孔加入 150 μl 二甲亞砜溶解結晶。在 SAF-680T 酶標儀(上海巴玖實業(yè)有限公司) 上選擇 490 nm 波長，測定各孔光吸收值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

5.實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)：按照 Trizol 試劑盒(Thermo Fisher Scientific 公司，美國) 步驟提取樣本總 RNA。采用紫外分光光度計(上海譜元儀器有限公司) 測定 RNA 濃度，并進行反轉錄試驗合成互補脫氧核糖核酸(complementary DNA， cDNA)。按照 SYBR? Premix EX TaqTM Ⅱ PCR Kit 試劑盒(Takara 公司，日本) 步驟以合成的 cDNA 作為模版在 LightCycler480 實時熒光定量 PCR 儀(Roche 公司，瑞士) 上進行熒光定量 PCR 反應。反應總體系為：cDNA 模版 1 μl，Premix Mix 10 μl，上下游引物各 0.5 μl，無 RNA 酶去離子水 8 μl。反應條件為：95 ℃ 10 min，隨后 98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。引物購自上海生工生物工程有限公司。人 miR-145 上游引物：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，下游引物：5’-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3’；人 U6 上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

6.酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)：收集轉染后的 C-20 / A4 和 CH8 細胞，根據(jù)白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 和 IL-13 ELISA 試劑盒(Proteintech 公司，美國) 步驟裂解細胞、靜置 30 min、離心，留取上層血清。采用酶標儀測定吸光度并計算炎癥因子濃度。

7.蛋白質印跡：收集轉染后的 C-20 / A4 和 CH8 細胞，加入 150 μl 放射免疫沉淀測定(radio immunoprecipitation assay，RIPA) 裂解液連同 1.5 μl 蛋白酶抑制劑，冰上孵育 30 min，4 ℃，13 000 g， 離心 30 min，獲取總蛋白。通過 12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) 分離總蛋白，每孔上樣為 30 μg，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜用 5% 脫脂牛奶在 37 ℃ 下封閉 2 h，并與抗胱天蛋白酶 3(caspase 3，CASP3)、cleaved CASP3 及 BAX 抗體(Abcam 公司，美國)(均 1∶1000 稀釋) 在 4 ℃ 下孵育過夜。采用 0.1% Tween-20 / TBS 緩沖液中洗滌 3 次后，將膜與抗鼠辣根過氧化物酶共軛的二抗(Abcam 公司，美國)(1∶2000 稀釋) 在 37 ℃ 下孵育 1 h。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) 蛋白用作內參對照。采用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminecence，ECL) 檢測蛋白條帶。

二、統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)采用x-±s表示。統(tǒng)計分析采用 Student’st或 ANOVA 檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、不同濃度 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞中炎癥因子及 miR-145 的表達水平分析

利用 0、5、10、15 及 30 ng / ml TNF-α 誘導人 C-20 / A4 和 CH8 關節(jié)軟骨細胞 48 h，細胞形態(tài)學如圖 1a 所示，隨著 TNF-α 誘導濃度的提高，凋亡細胞明顯增多。ELISA 結果顯示，隨著 TNF-α 誘導濃度的提高，C-20 / A4 和 CH8 細胞中炎癥因子 IL-1β、IL-6 及 IL-13 的濃度呈劑量依賴性升高(P< 0.05)(圖 1b)。qRT-PCR 結果顯示，C-20 / A4 和 CH8 細胞中 miR-145 的表達水平呈劑量依賴性降低(P< 0.05)(圖 1c)。

圖1 不同濃度 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞中炎癥因子及 miR-145 的表達水平分析 a：細胞培養(yǎng)圖；b：炎癥因子；c：miR-145。*P < 0.05Fig.1 Analysis of the expression level of inflammatory factors and miR-145 in human articular chondrocytes induced by different concentrations of TNF-α a: Images of cell culture; b: Inflammatory factors; c: miR-145.*P < 0.05

二、miR-145 mimics 轉染效率分析

qRT-PCR 結果顯示，與 mimics control 組相比較，miR-145 mimics 顯著提高 C-20 / A4 和 CH8 細胞中 miR-145 的表達水平(P< 0.05)(圖 2)。

圖2 miR-145 mimics 對 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞中 miR-145 表達水平的影響。*P < 0.05Fig.2 The effect of miR-145 mimics on the expression of miR-145 in human articular chondrocytes induced by TNF-α.*P < 0.05

三、過表達 miR-145 對 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞增殖及凋亡的影響

MTT 結果顯示，與 mimics control 組相比較，miR-145 mimics 顯著降低 C-20 / A4 和 CH8 細胞的增殖能力(P< 0.05)(圖 3a)。蛋白質印跡結果顯示，與 mimics control 組相比較，miR-145 mimics 顯著增加 CASP3、cleaved CASP3 及 BAX 的蛋白表達水平(P< 0.05)(圖 3b)。

圖3 過表達 miR-145 對 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞增殖與凋亡的影響 a：細胞生長曲線；b：凋亡相關蛋白的表達水平。*P < 0.05圖4 過表達 miR-145 對 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞炎癥反應的影響 a：C-20 / A4；b：CH8。*P < 0.05Fig.3 The effect of over-expression of miR-145 on the proliferation and apoptosis of human articular chondrocytes induced by TNF-α a: Cell growth curves; b: Apoptosis-related protein expression level.*P < 0.05Fig.4 The effect of over-expression of miR-145 on inflammatory response in human articular chondrocytes induced by TNF-α a: C-20 / A4; b: CH8.*P < 0.05

四、過表達 miR-145 對 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞炎癥反應的影響

ELISA 結果顯示，C-20 / A4 和 CH8 細胞轉染 miR-145 mimics 后炎癥因子 IL-1β、IL-6 及 IL-13 的濃度顯著高于 mimics control 組(P< 0.05)(圖 4)。

討論

OA 是一類由于關節(jié)軟骨基質的代謝平衡被打破，繼而引發(fā)關節(jié)產生退行性病變的慢性運動系統(tǒng)疾病。據(jù)最新統(tǒng)計，我國 65歲以上的老年人中約 80% 患有 OA。OA 可導致關節(jié)疼痛、僵硬、變形，甚至活動能力喪失，從而嚴重影響患者的日常生 活[13]。盡管目前臨床上有多種方法治療 OA，包括藥物、針灸、電磁、干細胞及手術等，但臨床療效仍然難令人滿意[14]。因此，有必要深入探索 OA 的發(fā)病機制以指導臨床診治。miRNA 是內源性非編碼 RNA，在 RNA 穩(wěn)定性和蛋白質表達的負調控中起著重要的作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，一部分 miRNA 在 OA 中表達異常并參與對關節(jié)軟骨細胞增殖、凋亡、自噬及炎癥反應的調控作用[15]。例如，Zhao 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-107 通過靶向腫瘤壞死因子受體相關因子 3(TNF receptor-associated factor 3，TRAF3) 調節(jié) OA 軟骨細胞的凋亡和自噬，并可能被用作 OA 治療的潛在靶點。Zhong 等[17]研究報道，miR-335-5p 通過激活自噬緩解 OA 軟骨細胞的炎癥反應。Wu 等[18]研究顯示，miR-181 通過靶向 10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN) 上調 CASP3，聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶 [ poly(ADP-ribose) polymerase，PARP ]，基質金屬蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2，MMP-2) 和 MMP-9 的表達，從而抑制 OA 軟骨細胞增殖并促進凋亡。此外，Yu 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a 通過 NF-κB 信號通路正調控性別決定區(qū) Y 框蛋白 9(SRY-box transcription factor 9，SOX9) 促進軟骨細胞的生存和遷移。因此，鑒定與軟骨細胞中相關的 miRNA 對進一步闡明 OA 發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要的理論價值，亦將為該病的治療提供新的思路。

miR-145 定位于人第 5 號染色體長臂 3 區(qū) 2 帶。眾所周知，miR-145 是一種抑癌基因，過表達 miR-145 可抑制癌細胞增殖并誘導凋亡[8]。例如，miR-145 通過調節(jié) BAX 和 CASP3 表達抑制非小細胞肺癌增殖[20]。miR-145 靶向調控性別決定區(qū) Y 框蛋白 11(SRY-box transcription factor 11，SOX11) 表達抑制子宮內膜癌細胞增殖[21]。miR-145 負調節(jié)轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 表達降低乳腺癌生長并促進凋亡[22]。目前，關于 miR-145 在 OA 發(fā)生發(fā)展中的作用尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究通過建立 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞模型，發(fā)現(xiàn)隨著 TNF-α 誘導濃度的提高，C-20 / A4 和 CH8 細胞中炎癥因子包括 IL-1β、IL-6 及 IL-13 的表達水平呈劑量依賴性升高。該結果結合細胞形態(tài)學改變，提示 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞建立 OA 體外模型是成功可靠的。有趣的是，筆者還發(fā)現(xiàn) miR-145 的表達水平呈劑量依賴性降低。鑒于 miR-145 在對癌細胞增殖與凋亡中的調控作用，因此筆者推測 miR-145 在 OA 軟骨細胞可能具有相似的功能。

由于 30 ng / ml TNF-α 誘導 C-20 / A4 和 CH8 細胞中 miR-145 的表達量最低，于是選擇該劑量作為后續(xù)實驗的主要模型。為了進一步證實推測，筆者通過瞬時轉染 miR-145 mimics 至 30 ng / ml TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞，并采用 MTT 和蛋白質印跡觀察細胞增殖與凋亡的變化。結果發(fā)現(xiàn)，過表達 miR-145 抑制 C-20 / A4 和 CH8 細胞增殖并誘導凋亡，表現(xiàn)為 CASP3、cleaved CASP3 及 BAX 的蛋白表達水平增加。該結果與 miR-145 在癌細胞中的作用一致，提示 miR-145 通過調控人關節(jié)軟骨細胞增殖與凋亡影響 OA 進展。然而最近 Hu 等[23]一項研究發(fā)現(xiàn) miR-145 對 TNF-α 誘導大鼠關節(jié)軟骨細胞增殖沒有明顯影響，筆者認為引起這種差異的主要原因為細胞系不同所致。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應與 OA 發(fā)生密切相關并影響疾病的進展[24]。OA 軟骨細胞中炎癥因子如 IL-1β、IL-6 及 IL-13 表達升高，并與疾病疼痛程度相關[25]。目前，已報道了幾種 miRNA 在 OA 抗感染中發(fā)揮重要作用，如 miR-27a[26]、 miR-93[27]及 miR-142-3p[28]。為了檢測 miR-145 對 OA 炎癥反應的影響，筆者采用 ELISA 觀察轉染 miR-145 mimics 后 TNF-α 誘導人關節(jié)軟骨細胞中炎癥因子的濃度變化。結果顯示，過表達 miR-145 促進 C-20 / A4 和 CH8 細胞炎癥反應，表現(xiàn)為 IL-1β、IL-6 及 IL-13 濃度升高。該結果提示，miR-145 可調控人關節(jié)軟骨細胞炎癥反應而影響 OA 進展。

綜上所述，本研究觀察到 miR-145 在 TNF-α 誘導的人關節(jié)軟骨細胞中呈劑量依賴性下調，并初步揭示體外過表達 miR-145 抑制 TNF-α 誘導的人關節(jié)軟骨細胞增殖，促進凋亡及炎癥反應，提示 miR-145 可能被用作 OA 治療的潛在分子靶點。