張曉輝 柳依江 杜若桑 崔 海

（首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是由外力作用于頭部所造成的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷，它的發(fā)病率和病死率較高［1-2］，給家庭和社會造成很大危害。谷氨酸興奮性毒性、細(xì)胞凋亡等參與到TBI后繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生機(jī)制中。谷氨酸（GLU）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的神經(jīng)興奮性傳遞信號，同時也具有神經(jīng)毒性，當(dāng)細(xì)胞外液GLU濃度過高時會對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，引起神經(jīng)元凋亡。腦內(nèi)最主要的GLU清除劑是星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（EAAT2），在嚙齒動物中稱為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（GLT-1），它可轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外多余的GLU到膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，防止GLU蓄積所引起的神經(jīng)元興奮性毒性來保護(hù)神經(jīng)元［3］。本實驗通過觀察TBI大鼠腦組織中GLT-1的表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況來探討電針對TBI大鼠的腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量280～320 g，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，光照/黑暗周期為12 h/12 h，自由飲水進(jìn)食。

1.2 儀器與試劑

精密顱腦損傷撞擊器PCI3000（美國Hatteras in?struments公司），68025型腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命技術(shù)有限公司），動物組織RNA提取試劑盒（DP431）、TIANScriptⅡRT Kit（KR107-02）、定量試劑盒 SuperReal PreMix Plus（SYBR GreenFP205-02）均購自天根生化科技有限公司、華佗牌一次性無菌針灸（0.30mm×13mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 模型制備

根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分成4組，假手術(shù)組、TBI組、手針組和電針組，每組10只。大鼠禁食12 h后以10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.4 mL/100 g），俯臥位固定于腦立體定位儀，備皮消毒后，在大鼠眼睛后方沿正中線做長約1.5 cm的縱向切口，暴露出前囟。在前囟向右旁開2.5 mm，向后旁開1.5 mm處為圓心，用顱鉆鉆出直徑約6 mm的孔，保持硬腦膜完整。隨后應(yīng)用PCI3000撞擊器（打擊參數(shù)設(shè)置為撞擊頭直徑4 mm，打擊速度4 m/s，打擊深度2 mm，停留時間100 ms）撞擊此處造成TBI模型，隨后清理創(chuàng)口，將骨瓣還納于骨窗中，用組織膠水封閉，最后縫合頭皮。

1.4 干預(yù)方法

手針組在造模后隨即固定于自制鼠套內(nèi)，針刺人中，雙側(cè)風(fēng)池、內(nèi)關(guān)。穴位定位按照《大鼠穴位圖譜的研制》［4］取穴，人中在鼻中隔下部向上斜刺約1 mm，捻轉(zhuǎn)10 s后出針；內(nèi)關(guān)直刺約2 mm，風(fēng)池向后斜刺3 mm，二穴行平補(bǔ)平瀉手法后留針15 min，每日1次，共干預(yù)7 d。電針組針刺穴位方法同手針組，風(fēng)池和內(nèi)關(guān)進(jìn)針后快速捻轉(zhuǎn)1 min后，接華佗牌SDZ-V型電子針療儀，正極在風(fēng)池穴，負(fù)極在同側(cè)內(nèi)關(guān)穴，電針參數(shù)采用連續(xù)波，頻率為2 Hz，電流強(qiáng)度以大鼠肢體輕微抖動為度，留針15 min，每日1次，共干預(yù)7 d。假手術(shù)組僅打開骨窗，不予撞擊，TBI組造模后不進(jìn)行干預(yù)，兩組大鼠均被抓取并固定于自制鼠套內(nèi)15 min，每日1次，共干預(yù)7 d。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）

在干預(yù)的第2、4、7天使用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分量表（mNSS）進(jìn)行神經(jīng)功能評分［5］，包括運(yùn)動、感覺、平衡、反射實驗和異常體征，總分18分，分值越高，提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤 第7天干預(yù)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只大鼠麻醉，快速開胸暴露心臟，迅速經(jīng)左心室-升動脈插管，相繼灌注生理鹽水和4%多聚甲醛后斷頭取腦，將大鼠全腦標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定48 h。以損傷部位為中心，切取厚約4 mm左右的標(biāo)本，進(jìn)行石蠟包埋。切取合適部位約1 cm，用4%多聚甲醛固定24 h以上。經(jīng)漂洗、脫水、透明、浸泡等步驟處理后，切成5 μm厚的切片。再烤干、脫蠟、浸水等步驟處理后，用蘇木素和伊紅分別染色。染色結(jié)束后，經(jīng)75%、85%、95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光學(xué)顯微鏡（20倍）下觀察炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.6.2 TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡 上述灌注、固定腦組織后，在打擊周圍切取約1 cm腦組織，切片常規(guī)脫蠟入水后予以內(nèi)源性過氧化物酶，然后標(biāo)本片依次加緩沖液、封閉液、抗體稀釋液。最后DAB顯色，予以甘油封片，在光學(xué)顯微鏡（40倍）下觀察陽性細(xì)胞數(shù)，染色陽性細(xì)胞為棕黃色或深棕褐色。

1.6.3 實時熒光定量PCR 將每組剩余的5只大鼠麻醉后，斷頭取腦，置于冰上迅速分離缺損周圍腦組織，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，設(shè)計和合成引物（見表1），反轉(zhuǎn)錄cDNA，用BIOER PCR儀擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析，對基因的mRNA含量進(jìn)行分析。

表1 目的基因引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠mNSS評分比較

見表2。在第2天，TBI組、手針組、電針組mNSS評分均高于假手術(shù)組，且TBI組與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明造模成功。在第4天和第7天，手針組和電針組評分雖都降低，但電針組比TBI組減少更為顯著（P<0.01），說明電針的療效優(yōu)于手針組。

表2 各組大鼠不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較（分±s）

表2 各組大鼠不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較（分±s）

注：與假手術(shù)組比較，?P<0.05，??P<0.01；與 TBI組比較，#P<0.05，##P<0.01。下同。

組別假手術(shù)組TBI組手針組電針組n 5 5 5 5第2天0 15.50±1.38**12.50±1.05 12.17±0.75第4天0 15.50±1.05**7.50±1.05*3.17±0.98##第7天0 15.33±0.52**5.33±1.21*2.00±0.89##

2.2 各組大鼠腦組織炎性細(xì)胞數(shù)比較

見表3，圖1。與假手術(shù)組相比，TBI組和手針組炎性細(xì)胞數(shù)量升高且有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01或P<0.05）；與TBI組相比，電針組炎性細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P<0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織炎性浸潤情況（HE染色，20倍）

表3 各組大鼠炎性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)比較（個/mm2±s）

表3 各組大鼠炎性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)比較（個/mm2±s）

組別假手術(shù)組TBI組手針組電針組n 5 5 5 5炎性細(xì)胞數(shù)7.00±1.23 50.16±4.07**22.12±0.66*11.80±1.10#凋亡細(xì)胞數(shù)2.27±0.89 24.60±0.98**16.13±1.07*8.87±0.89#

2.3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡比較

見表3，圖2。與假手術(shù)組相比，TBI組和手針組凋亡細(xì)胞數(shù)目增多且有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01或P<0.05）；與TBI組相比，電針組炎性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況（DAB顯色，40倍）

2.4 各組大鼠腦組織GLT-1 mRNA含量比較

見表4。與假手術(shù)組相比，TBI組GLT-1 mRNA含量明顯降低（P<0.05），電針組含量明顯升高（P<0.01）；與TBI組比較，電針組和手針組GLT-1 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）；電針組的GLT-1 mRNA的表達(dá)量顯著高于手針組（P<0.01）。

表4 各組大鼠腦組織GLT-1 mRNA表達(dá)水平比較±s）

表4 各組大鼠腦組織GLT-1 mRNA表達(dá)水平比較±s）

注：與手針組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

組別假手術(shù)組TBI組手針組電針組GLT-1 mRNA 1.00±0.00 0.63±0.20*0.99±0.16#2.09±0.11**##△△n 5 5 5 5

3 討 論

TBI分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷因難以治療，故目前研究主要集中于繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上經(jīng)過一系列病理生理過程，包括谷氨酸興奮性毒性、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等反應(yīng)［6］，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步損傷。

TBI屬于中醫(yī)學(xué)中“頭部內(nèi)傷病”［7］，病因病機(jī)最早記載于《靈樞》“若有所墜墮，惡血留內(nèi)而不去”。陳實功所著《外科正宗·卷之四》中記載“如從高墜墮而未經(jīng)損破皮肉者，必有瘀血流注臟腑，人必昏沉不省”。歷代醫(yī)家認(rèn)為TBI病機(jī)為腦部受損，瘀血內(nèi)停，氣機(jī)受阻，阻滯經(jīng)絡(luò)。對TBI大鼠干預(yù)的腧穴配伍選擇基于顱腦損傷中醫(yī)診療方案和文獻(xiàn)檢索統(tǒng)計［8］而確定為人中、風(fēng)池、內(nèi)關(guān)3穴，該方案結(jié)合了國家中醫(yī)藥管理局顱腦損傷協(xié)作組專家經(jīng)驗，經(jīng)4輪專家意見征詢及修改完成［9］。人中屬督脈，督脈“入屬于腦”，作為急救要穴，可醒腦開竅；風(fēng)池位于頭頸部，亦可醒腦開竅，疏經(jīng)通絡(luò)；內(nèi)關(guān)屬心包經(jīng)，可調(diào)理心氣，促進(jìn)氣血運(yùn)行。針刺治療可發(fā)揮開竅醒神，行氣活血化瘀，疏通經(jīng)絡(luò)的作用。課題組前期研究表明分別在術(shù)后6 h、1 d、3 d、5 d針刺相同穴位發(fā)現(xiàn)針刺可顯著降低膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、S-100B的蛋白水平和改善TBI后神經(jīng)功能損傷，從而減輕TBI大鼠的腦損傷［10］。研究表明針刺水溝、內(nèi)關(guān)下調(diào)缺血腦組織中Caspase-3、聚ADP核糖聚合酶-1（PARP-1）蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡［11］。

GLU的過度釋放是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷神經(jīng)元死亡的重要機(jī)制之一。TBI后，GLT-1轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸能力受到抑制，大量GLU不能被及時清除，使腦內(nèi)谷氨酸濃度明顯升高，激活NMDA受體，導(dǎo)致Na+、Ca2+等離子通道通透性增加，大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起自由基的大量產(chǎn)生［12-14］，也可以引起神經(jīng)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜損傷，蛋白質(zhì)水解，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［15］。大量實驗表明電針可以上調(diào)腦缺血損傷部位EAAT2蛋白的表達(dá)，降低CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)目［16-18］。但在TBI中鮮有文獻(xiàn)報道。

本實驗研究結(jié)果表明，TBI組中大鼠GLT-1 mRNA表達(dá)顯著降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量和神經(jīng)功能評分明顯增加，表明TBI誘導(dǎo)并加重了腦損傷程度；手針和電針干預(yù)后大鼠GLT-1 mRNA表達(dá)顯著升高，神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量和神經(jīng)功能評分明顯減少，表明針刺可減輕腦損傷程度，而且電針干預(yù)效果優(yōu)于手針。

綜上，本實驗表明針刺干預(yù)可提高TBI模型大鼠GLT-1的表達(dá)，抑制谷氨酸興奮性毒性，降低細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞浸潤和神經(jīng)功能評分，減輕腦損傷程度且電針干預(yù)效果優(yōu)于手針。課題組將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，選取多個時間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行整體趨勢觀察，并結(jié)合多種檢測方法進(jìn)一步研究其機(jī)制和電針干預(yù)TBI的最優(yōu)參數(shù)。