張文強 黃涌瀾 楊 威 陳文培 代彩玲 李小英 向飛軍△ 郭健敏△

（1.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評價研究企業(yè)重點實驗室，國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評價分中心，廣東省創(chuàng)新藥物評價與研究工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510990；2.廣州一品紅制藥有限公司，廣東 廣州 510760）

哮喘又名支氣管哮喘，是一種由復雜細胞組分及因子共同參與的常見多發(fā)性疾病，多以肺部可逆性氣流阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征，為臨床上兒科最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾?。?］。馥感啉口服液主要由鬼針草、野菊花、西洋參、黃芪、板藍根等組成，具有清熱解毒、止咳平喘、益氣疏表的作用，多用于小兒氣虛感冒所引起的發(fā)熱、咳嗽、氣喘、咽喉腫痛。有研究報道馥感啉口服液還具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘、耐寒、抗炎及體外抑菌作用［2］。本研究旨在通過塵螨誘發(fā)的幼齡大鼠哮喘模型來考察馥感啉口服液對該哮喘模型的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 48只SPF級SD大鼠，3周齡，雌雄各半，體質(zhì)量50～80 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)于廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司五樓屏障環(huán)境動物房，動物自由攝食、飲水，動物房環(huán)境溫度控制在20～26℃，相對濕度40%～70%，最小換氣次數(shù)15次/h，12 h光照/黑暗交替。本研究經(jīng)廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司動物福利與倫理委員會審核通過。

1.2 實驗藥物 馥感啉口服液由廣州一品紅制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格30 mL/支，含量1 099 μg/mL，產(chǎn)品批號SY10119001；硫酸特布他林片由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格2.5 mg/片，批號1709089。

1.3 試劑與儀器 屋塵螨變應原制劑（ALK-Abelló A/S公司，批號：B6553），戊巴比妥鈉注射液（Alfasan Inte?national B.V公司，批號：1709296-02），IgE、His ELISA試劑盒（廣州開晨生物科技有限公司，批號：E20200701A）。超聲霧化器（日本OMRON，型號NB-150U），振蕩式肺功能檢測系統(tǒng)（法國SCIREQ，型號FlexiVent），全自動血液體液分析儀（日本SYSMEX，型號XN-1000），酶標分析儀（美國BioTek，型號ELx808），生物顯微鏡（德國LEICA，型號DM3000）。

1.4 分組與造模 選用適應性觀察合格的幼齡大鼠48只，按照體質(zhì)量和性別采用隨機數(shù)字表法均衡分為6組，分別為陰性對照組、模型對照組、陽性對照組（予硫酸特布他林片）、馥感啉低、中、高劑量組，每組8只動物，雌雄各半。分組后據(jù)文獻資料［3-4］及筆者關(guān)于過敏性哮喘既往的造模經(jīng)驗建立幼齡大鼠哮喘模型。造模方法：除陰性對照組以PBS溶液致敏和激發(fā)外，其余各組大鼠均于分組后腹腔注射屋塵螨變應原制劑（1000 SQ-U/mL，0.1 mL/只），每天注射1次，連續(xù)3 d，末次致敏后間隔14 d進行激發(fā)，激發(fā)方法：動物置于霧化裝置中，每天不間斷霧化吸入屋塵螨變應原制劑（2000 SQ-U/mL）5 min，連續(xù)霧化激發(fā)7 d。

1.5 干預方法 幼齡大鼠給藥劑量參照《毒理學教程》按體表面積等效劑量法進行折算［5］，設定馥感啉口服液給藥劑量分別為5.26、10.53、21.05 g/kg，按體表面積等效劑量法折算，約相當于4歲兒童臨床擬定用量（40 g/d，以市售樣品生藥濃度計）的1、2、4倍。設定陽性對照組（硫酸特布他林片）的給藥劑量為0.72 mg/kg，按體表面積等效劑量法折算，約相當于4歲兒童臨床用量（2.73 mg/d）的2倍。各組動物均于激發(fā)第1天開始灌胃給藥，給藥體積為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)7d，陰性對照組、模型對照組均給予等體積的純水，陽性對照組于前4 d給予等體積的純水，后3d給予硫酸特布他林藥液。

1.6 標本采集與檢測 各組大鼠均于末次激發(fā)后，采用1.5%戊巴比妥鈉注射液（50 mg/kg）尾靜脈注射麻醉，然后行頸部正中氣管切開并插管，測定呼吸系統(tǒng)阻力（Rrs）、呼吸系統(tǒng)順應性（Crs）及呼吸系統(tǒng)彈性（Ers）。測定結(jié)束后采用腹主動脈采血法將動物安樂死，取全血測定白細胞總數(shù)，剩余血液不抗凝，分離血清，用于IgE、His表達水平的測定。剖取動物肺臟稱取質(zhì)量計算肺臟系數(shù)，（肺臟系數(shù)=肺臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。然后將各組動物肺臟組織用10%甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色后，光鏡下觀察各組動物的肺臟組織病理學變化。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺功能指標檢測結(jié)果比較 見表1。與陰性對照組相比，模型對照組動物Rrs、Ers均顯著升高，Crs顯著降低（P<0.05或P<0.01或P<0.001）；與模型對照組相比，陽性對照組、馥感啉口服液高劑量組動物Rrs、Ers均顯著降低，Crs顯著升高（P<0.05或P<0.01）；馥感啉口服液低劑量組動物Crs顯著升高，低、中劑量組動物Ers顯著降低，Rrs均有降低趨勢（P>0.05），中劑量組動物Crs無顯著差異（P>0.05）。

表1 各組大鼠肺功能指標檢測結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠肺功能指標檢測結(jié)果比較（±s）

注：與模型對照組比較，?P<0.05，??P<0.01；與陰性對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001。1 cmH2O≈0.098 kPa。下同。

組別陰性對照組模型對照組陽性對照組馥感啉低劑量組馥感啉中劑量組馥感啉高劑量組n 8 8 8 8 8 8 Rrs（cmH2O·s/mL）0.1126±0.0020 0.1363±0.0052△0.1104±0.0022*0.1172±0.0015 0.1166±0.0027 0.1119±0.0016*Crs（mL/cmH2O）0.7715±0.0269 0.5554±0.0309△△△0.6927±0.0221*0.6619±0.0293*0.6030±0.0597 0.7107±0.0349**Ers（cmH2O/mL）1.3790±0.0506 1.7912±0.0778△△△1.5026±0.0325**1.5363±0.0832*1.4477±0.0825**1.4821±0.0675**

2.2 各組大鼠肺臟系數(shù)比較 見表2。與陰性對照組相比，模型對照組動物肺臟系數(shù)顯著升高（P<0.05）。與模型對照組相比，陽性對照組、馥感啉口服液中、高劑量組動物肺臟系數(shù)顯著降低（P<0.05）。馥感啉口服液低劑量組動物肺臟系數(shù)有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠肺臟系數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠肺臟系數(shù)比較（±s）

組別陰性對照組模型對照組陽性對照組馥感啉低劑量組馥感啉中劑量組馥感啉高劑量組8 8 8 8 8 8 287.00±22.00 286.00±21.00 304.00±23.00 294.00±23.00 299.00±26.00 295.00±22.00 1.39±0.08 1.57±0.09 1.44±0.08 1.42±0.06 1.43±0.06 1.41±0.07 0.48±0.01 0.55±0.02△0.48±0.02*0.50±0.03 0.49±0.03*0.49±0.02*n 體質(zhì)量（g） 肺臟質(zhì)量（g） 肺臟系數(shù)（%）

2.3 各組大鼠白細胞總數(shù)比較 見表3。與陰性對照組相比，模型對照組動物白細胞總數(shù)顯著增多（P<0.05）。與模型對照組相比，馥感啉口服液高劑量組動物白細胞總數(shù)顯著減少（P<0.05）。陽性對照組、馥感啉口服液低、中劑量組白細胞總數(shù)均有降低趨勢，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 各組大鼠血液中白細胞總數(shù)比較（×109/L±s）

表3 各組大鼠血液中白細胞總數(shù)比較（×109/L±s）

組別陰性對照組模型對照組陽性對照組馥感啉低劑量組馥感啉中劑量組馥感啉高劑量組n 8 8 8 8 8 8白細胞總數(shù)2.80±0.34 6.22±0.55△△5.15±0.79 5.13±0.55 4.04±0.41 3.66±0.27*

2.4 各組大鼠血清IgE及His表達水平比較 見表4。與陰性對照組相比，模型對照組動物血清中IgE、His表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型對照組相比，馥感啉口服液中、高劑量組IgE、His表達水平均顯著降低（P<0.05）；馥感啉口服液低劑量組IgE表達水平有降低趨勢，差異不明顯（P>0.05），陽性對照組及馥感啉口服液低劑量組His表達水平均無顯著差異（P>0.05）。

表4 各組大鼠血清IgE及His表達水平比較（±s）

表4 各組大鼠血清IgE及His表達水平比較（±s）

組別陰性對照組模型對照組陽性對照組馥感啉低劑量組馥感啉中劑量組馥感啉高劑量組n 8 8 8888 IgE（μg/mL）22.02±0.85 25.02±0.49△△23.93±0.68 23.31±0.47 23.12±0.40*22.95±0.76*His（ng/mL）11.67±0.16 12.54±0.22△△12.12±0.22 12.14±0.24 11.83±0.19*11.91±0.24*

2.5 各組大鼠肺組織病理學檢查結(jié)果 見圖1。陰性對照組動物肺臟各級管腔結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔無擴張或縮小，間質(zhì)支氣管/血管無疏松或狹窄，亦未見炎細胞浸潤；模型對照組動物肺臟氣道壁皺縮、血管周圍疏松/水腫、支氣管/血管間質(zhì)炎細胞（以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主）浸潤，而陽性對照組、馥感啉口服液低、中、高劑量組動物上述病變均有不同程度的減輕。

圖1 各組大鼠肺臟組織病理學變化（HE染色，100倍）

3 討 論

哮喘發(fā)病率逐年增加，病程長且反復，其病因主要包括遺傳和促發(fā)因素兩個方面。哮喘具有明顯的家族患病聚集趨勢，患者后代患病率高于普通群體后代患病率［6-7］。促發(fā)因素包括吸入性、感染類、食物性和藥物性抗原等，其中吸入性抗原主要以有機粉塵（如塵螨等）為主，其種類繁多，亦被認為是城鎮(zhèn)哮喘發(fā)病的主要原因之一［8-9］。馥感啉口服液現(xiàn)有臨床適應證主要為清熱解毒、止咳平喘、益氣解表等，功能主治為小兒氣虛感冒所引起的發(fā)燒、咳嗽、氣喘、咽喉腫痛等。馥感啉口服液組方中的浙貝母、麻黃、前胡具有解表清熱、化痰平喘之功效，甘草調(diào)和諸藥相輔相成，使其功能綿延而不強烈［10］。本研究在馥感啉口服液現(xiàn)有的主治功能基礎(chǔ)之上著重探究其平喘之功效，考察了其對幼齡哮喘動物的治療效果。

有機粉塵性哮喘是過敏性哮喘主要類型之一，但由于有機粉塵類誘喘劑較卵清蛋白（OVA）、花粉及真菌孢子粗浸液等制備困難，因此該類動物模型的制作相對較少［8］?，F(xiàn)有研究中多采用屋塵螨粗浸液，其成分較為復雜，很難復制出天然的塵螨致幼齡動物過敏性哮喘模型。本研究采用吸附于氫氧化鋁上的屋塵螨變應原制劑對4周齡大鼠進行腹腔注射致敏，間隔2周后進行霧化激發(fā)，該誘喘劑致敏、激發(fā)后在幼齡動物體內(nèi)緩慢釋放，不斷刺激動物發(fā)育階段的呼吸系統(tǒng)，較好地模擬出臨床上兒童因長期處于粉塵環(huán)境中而導致的過敏性哮喘疾病。有機粉塵性哮喘特點是阻塞性肺功能障礙、黏液分泌過多、氣道炎癥及輕中度氣道重塑，本試驗結(jié)合哮喘的發(fā)病機制［11-12］，采用屋塵螨對動物進行致敏和激發(fā)造模。激發(fā)期第4～7天，模型組動物陸續(xù)出現(xiàn)撓鼻、伸頸縮胸、呼吸急促、站立不穩(wěn)等癥狀，上述癥狀與馮高華老師等研究者采用OVA誘發(fā)的支氣管哮喘大鼠癥狀基本相似［13］。模型建立成功后筆者主要從肺功能、免疫應答、炎癥、肺水腫、肺組織病理學等幾個方面考察馥感啉口服液對幼齡動物哮喘的改善作用。首先采用振蕩式肺功能檢測系統(tǒng)測定大鼠的肺功能指標，結(jié)果顯示模型對照組動物呼吸系統(tǒng)阻力及彈性均顯著升高，順應性顯著降低，表明模型動物已具有明顯的呼吸功能障礙。病理學檢查發(fā)現(xiàn)模型對照組動物表現(xiàn)出明顯的氣道壁皺縮，血管周圍疏松/水腫。推斷上述病理變化為導致模型動物呼吸系統(tǒng)阻力及彈性升高、順應性下降的主觀因素，而馥感啉口服液低、中、高劑量下對動物呼吸系統(tǒng)阻力及彈性的降低均有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用，進而導致動物的順應性升高。綜合病理學結(jié)果表明，馥感啉口服液可以很好地緩解幼齡哮喘動物的氣道壁皺縮，血管周圍疏松/水腫，改善幼齡哮喘動物的呼吸功能。

變應原進體內(nèi)后，經(jīng)抗原呈遞作用，由淋巴細胞的調(diào)控作用分泌特異性IgE［14］，IgE黏附于肥大細胞或嗜酸、嗜中性粒細胞之上，從而釋放多種過敏介質(zhì)（如組胺、前列腺素、白三烯等），進而導致哮喘患者氣管平滑肌收縮、黏液分泌增加、炎癥細胞浸潤等，炎癥細胞合成并釋放出炎性介質(zhì)及細胞因子，引起氣道炎癥反應，這種炎癥反應一般是反復且長期的過程［15］。本研究結(jié)果顯示模型對照組動物血液中白細胞總數(shù)、血清中IgE、His表達水平及肺臟系數(shù)均顯著升高，說明模型動物已處于免疫抵抗及炎癥反應中，并由炎癥反應導致肺部水腫。病理學檢查發(fā)現(xiàn)模型對照組動物亦表現(xiàn)出明顯的支氣管/血管間質(zhì)炎細胞浸潤，而馥感啉口服液低、中、高劑量組動物肺臟系數(shù)、白細胞總數(shù)及IgE、His表達水平均有不同程度的下降，支氣管/血管間質(zhì)炎細胞浸潤具有一定的減輕作用。上述結(jié)果表明馥感啉口服液對幼齡哮喘動物的氣道炎癥及水腫具有良好的減輕作用。氣道炎癥及水腫或氣道重塑引起的氣道高反應性是哮喘的重要病理生理特征［16］，本團隊后續(xù)計劃通過離體試驗進一步探索馥感啉口服液對氣道高反應性的作用及可能的作用機制。

綜上所述，馥感啉口服液對屋塵螨誘發(fā)的幼齡大鼠哮喘具有良好的治療效果，其能夠改善模型動物的呼吸系統(tǒng)功能，減輕氣道炎癥及水腫。