楊 陽(yáng) 張 迪 王 佳 黃程程 王有鵬

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001）

哮喘是兒童最常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特征是慢性氣道炎癥、可逆性氣道阻塞、氣道重塑、黏液分泌增加和氣道高反應(yīng)性［1］。哮喘發(fā)作的常見(jiàn)誘因包括病毒感染、暴露于過(guò)敏原和（或）污染物、吸煙、突然的溫度變化、壓力和運(yùn)動(dòng)等［2-3］。目前，全球約有3.34億人和10%的兒童受到影響，構(gòu)成了嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題［4-6］。近年哮喘的發(fā)病率不斷上升，預(yù)計(jì)2025年可達(dá)4億［7-8］。中醫(yī)中藥治療兒童疾病優(yōu)勢(shì)近年來(lái)受到重視，很多學(xué)者也開(kāi)始深入研究經(jīng)典方劑治療哮喘的作用機(jī)制，不但可以更好地治療疾病，還為醫(yī)學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

溫膽湯最早記載于南北朝時(shí)期醫(yī)家姚僧垣的《集驗(yàn)方》［9-10］，不同醫(yī)家對(duì)其方義闡釋不同，主要包括清熱化痰、解郁化痰、達(dá)膽和胃、和胃降膽以及分消走泄等功效?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)溫膽湯的應(yīng)用非常廣泛，尤其在治療兒童疾病中應(yīng)用越來(lái)越多，對(duì)過(guò)敏性疾病的防治效果頗佳，已有臨床觀察證實(shí)溫膽湯加減可以治療兒童哮喘。有關(guān)實(shí)驗(yàn)對(duì)溫膽湯中的成分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中有部分成分可以用于治療哮喘［11］。筆者通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)溫膽湯主要成分治療哮喘進(jìn)行探討，通過(guò)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，獲得溫膽湯治療哮喘可能的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 獲取溫膽湯中主要中藥有效成分及藥物靶點(diǎn)使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選溫膽湯中主要藥物的活性化合物，分別輸入“半夏”“陳皮”“茯苓”“枳實(shí)”，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug like，DL）≥0.18。

1.2 檢索哮喘靶點(diǎn)基因 分別在Gene Cards（https：//www.geneca-rds.org/）和在線人類孟德?tīng)栠z傳（OMIM，https：//omim.org/）中輸入“asthma”進(jìn)行檢索，并將兩個(gè)表格進(jìn)行整合。

1.3 溫膽湯藥物活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.1”獲得的溫膽湯主要藥物的活性成分及核心靶點(diǎn)相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。使用STRING平臺(tái)（https：//string-db.org/）可以構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO分析 使用R語(yǔ)言軟件對(duì)溫膽湯主要藥物與哮喘的共作靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，并得到GO分析的條形圖、氣泡圖。使用Perl將轉(zhuǎn)換的ID變成原始基因靶點(diǎn)。

1.5 KEGG通路富集分析及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的ID轉(zhuǎn)換文本文件，運(yùn)行R語(yǔ)言得到KEGG通路富集分析的條形圖、氣泡圖及文本文件。使用perl對(duì)獲得的KEGG文本文件進(jìn)行操作，輸入Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯與哮喘直接的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 溫膽湯主要藥物的活性成分 經(jīng)過(guò)TCMSP篩選后得到溫膽湯主要藥物的有效活性成分52個(gè)，其中半夏13個(gè)，陳皮5個(gè)，茯苓15個(gè)，枳實(shí)22個(gè)，陳皮、枳實(shí)共有3個(gè)，整合后可獲取藥物有效活性成分作用靶點(diǎn)603個(gè)。

2.2 潛在靶點(diǎn)信息 通過(guò)Gene Cards獲得哮喘的靶點(diǎn)基因5 974個(gè)，通過(guò)OMIM獲得哮喘靶點(diǎn)基因36個(gè)，將已經(jīng)獲得的溫膽湯中活性成分作用的靶點(diǎn)基因取交集，可獲得兩者的共同靶點(diǎn)有131個(gè)。

2.3 溫膽湯主要藥物中活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件，繪制溫膽湯主要藥物活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（如圖1），三角形代表靶點(diǎn)，橢圓形代表活性成分，其中藍(lán)色代表半夏，綠色代表陳皮，紫色代表茯苓，黃色代表枳實(shí)，紅色代表多味藥共同含有。連線越密集的節(jié)點(diǎn)越重要。將獲得的131個(gè)靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2，并運(yùn)用R語(yǔ)言提取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值中心性較高的前30位的核心基因，見(jiàn)圖3。

圖1 溫膽湯主要藥物中活性成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2 溫膽湯與哮喘靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 PPI的核心基因

2.4 GO富集分析 分析經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行后總共得到135個(gè)功能，獲取其中前20個(gè)的GO功能富集的條形圖和氣泡圖（見(jiàn)圖4、圖5）：富集越是顯著顏色越偏紅色，富集越少顏色越偏藍(lán)色；橫坐標(biāo)表示富集數(shù)目。

圖4 溫膽湯治療哮喘候選靶點(diǎn)的GO富集條形圖

圖5 溫膽湯治療哮喘候選靶點(diǎn)的GO富集氣泡圖

2.5 KEGG通路富集分析及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用R語(yǔ)言軟件對(duì)獲得的131個(gè)靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，運(yùn)行后得到30條通路。繪制顯著性前20的通路的條形圖和氣泡圖（見(jiàn)圖6、圖7）：橫坐標(biāo)表示靶點(diǎn)數(shù)，左邊表示通路名稱，通路上靶點(diǎn)數(shù)越多顏色越偏紅色，靶點(diǎn)數(shù)越少顏色越偏藍(lán)色。通過(guò)對(duì)富集前20的KEGG通路與基因之間的網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖8）：三角形代表通路，橢圓形代表基因，線代表相互鏈接，圖形越大代表相互關(guān)聯(lián)數(shù)量越多。

圖6 溫膽湯-哮喘潛在靶點(diǎn)KEGG通路條形圖

圖7 溫膽湯-哮喘潛在靶點(diǎn)KEGG通路氣泡圖

圖8 溫膽湯治療哮喘的KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

哮喘可歸為中醫(yī)學(xué)的“哮證”“喘證”等范疇。在《素問(wèn)·陰陽(yáng)別論》中“陰爭(zhēng)于內(nèi)，陽(yáng)擾于外，魄汗未藏，四逆而起，起則熏肺，使人喘鳴”，對(duì)哮喘的病因和癥狀進(jìn)行描述。后世《金匱要略》“咳而上氣，喉中水雞聲”，進(jìn)一步對(duì)癥狀及治療進(jìn)行記載。近現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者對(duì)哮喘的認(rèn)識(shí)更深入，對(duì)病因病機(jī)的不斷完善，治療上面的選方用藥更系統(tǒng)化、多樣化、全面化。通過(guò)溫膽湯加味治療哮喘的臨床觀察可以看出，其治療哮喘具有一定的療效，但是對(duì)于機(jī)制的研究尚未廣泛開(kāi)展。

通過(guò)對(duì)溫膽湯中的有效成分進(jìn)行分析，部分化合物已經(jīng)證實(shí)具有治療哮喘的作用，尤其是一些與基因關(guān)聯(lián)較多的活性成分，比如木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇等。木樨草素具有抑制哮喘氣道重塑及抑制哮喘氣道炎癥的作用［12］。β-谷甾醇具有抑菌抗炎的作用，多個(gè)治療哮喘的藥物都含有此成分［13-14］。柚皮素具有止咳化痰平喘的作用［15］。豆甾醇對(duì)哮喘氣道炎癥具有調(diào)節(jié)作用［16］。

通過(guò)對(duì)溫膽湯與哮喘的PPI網(wǎng)絡(luò)分析，核心基因?yàn)锳kt1、MAPK3、IL-6、VEGFA、FOS、JUN、MAPK1等。查閱文獻(xiàn)可知，AKT1的磷酸化變化可能在治療哮喘的療效中起重要作用［17］。MAPK3與MAPK1在MAPK信號(hào)通路中具有重要的作用，與調(diào)控氣管平滑肌細(xì)胞炎癥基因表達(dá)的重要信號(hào)酶相關(guān)［18］，MAPK信號(hào)通路與溫膽湯治療哮喘也具有相關(guān)性。IL-6近年被證實(shí)是哮喘的易感基因［19-20］。VEGFA在哮喘發(fā)病中起作用，如嗜酸性炎癥、杯狀細(xì)胞化生、氣道重塑以及氣道高反應(yīng)性，被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵介質(zhì)之一［21］。FOS與JUN等基因都參與了哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)等，從而使哮喘誘發(fā)或嚴(yán)重［22］。已有文獻(xiàn)證明，溫膽湯對(duì)某些疾病的患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物血清中的炎癥因子IL-6、VEGFA等有調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)組織中FOS及JUN等基因的表達(dá)。目前關(guān)于溫膽湯治療哮喘的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較少，分析獲得的基因?qū)⑹呛笃趯?shí)驗(yàn)的主要研究對(duì)象。

GO富集分析顯示GO功能富集后富集數(shù)目較多的有泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結(jié)合等。真核生物中泛素樣蛋白連接酶在許多細(xì)胞功能中起著核心作用，但目前針對(duì)其與哮喘的研究較少。磷酸酶是許多細(xì)胞信號(hào)傳遞的關(guān)鍵，可以激活信號(hào)通路，使其表現(xiàn)功能?？赏茰y(cè)溫膽湯通過(guò)參與多途徑治療哮喘，尤其是在細(xì)胞免疫等方面。淋巴細(xì)胞的失衡是哮喘發(fā)病機(jī)制的主要原因之一，免疫細(xì)胞參與哮喘的發(fā)病、發(fā)生、發(fā)展及治療。合理選擇中藥復(fù)方可以更好地通過(guò)細(xì)胞免疫等方面改善哮喘癥狀，不但使中藥治療疾病效果更佳，還可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使中醫(yī)藥更具有說(shuō)服力和應(yīng)用空間。

KEGG富集通路分析顯示溫膽湯治療哮喘主要通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗、細(xì)胞凋亡、cAMP信號(hào)通路等通路為主；KEGG通路與基因之間的網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)聯(lián)數(shù)量較多的基因主要有MAPK3、MAPK1、Akt1等。其中，最新研究表明，通過(guò)靶向PI3K/Akt整合素軸的氣道上皮修復(fù)是治療兒童喘息和哮喘的新途徑［23］。哮喘發(fā)生主要的因素是氣道炎癥與氣道重塑及氣道高反應(yīng)等，PI3K-Akt通路不但可以減輕氣道炎癥，還可以抑制氣道重塑，從而改善哮喘癥狀。氣道細(xì)胞凋亡的積聚可能是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的重要因素。凋亡細(xì)胞能否及時(shí)清除與哮喘的發(fā)生和病程有關(guān)［24］。研究發(fā)現(xiàn)，cAMP信號(hào)通路在多系統(tǒng)及細(xì)胞代謝等方面發(fā)揮著重要作用，其中某些基因的異常表達(dá)與哮喘病理生理的變化過(guò)程具有重要關(guān)聯(lián)［25］。還有文獻(xiàn)表明，該通路可能是肺腸同治哮喘的物質(zhì)基礎(chǔ)之一［26］。

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)溫膽湯治療哮喘進(jìn)展分析，推測(cè)其可能是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的相互關(guān)系進(jìn)行作用，可進(jìn)一步針對(duì)其影響氣道重塑、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫代謝等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)。溫膽湯治療哮喘的作用機(jī)制PI3K-Akt、cAMP等信號(hào)通路可能有關(guān)，作用于MAPK3、MAPK1、Akt1等相關(guān)受體。目前關(guān)于其中的機(jī)制研究較少，盡管以上結(jié)論是通過(guò)查閱數(shù)據(jù)庫(kù)所得，仍可為科研實(shí)驗(yàn)提供了新思路。本次獲得信號(hào)通路可能就是溫膽湯治療哮喘的主要通路，后期可通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)通路及相關(guān)因子進(jìn)行驗(yàn)證，以期為中醫(yī)藥的發(fā)展提供更好的基礎(chǔ)理論依據(jù)，為中醫(yī)藥的蓬勃發(fā)展做貢獻(xiàn)。