苑伯菲 宋立群， 代麗娟 于珊珊 贠 捷，△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150040）

慢性腎臟病發(fā)展至尿毒癥期的根本病理變化為腎臟纖維化，包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化（RIF），其中RIF是其主要病理形態(tài)特點。RIF受炎癥、氧化應激、自噬、細胞凋亡等多種因素調(diào)節(jié)，最終導致腎小管上皮細胞轉化成為肌成纖維細胞，促進RIF，引起腎功能減退。RIF程度與腎臟功能進展直接相關，目前尚無有效的徹底逆轉該過程的方法。Hippo信號通路是調(diào)節(jié)器官生長和組織大小的信號通路，其生理功能大多通過影響細胞增殖和細胞凋亡實現(xiàn)，因此，它在腎臟發(fā)育、腎小管上皮細胞凋亡、上皮細胞間充質(zhì)轉分化（EMT）、組織異常修復等多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。近期研究證明Hippo信號通路與腎臟病如糖尿病腎病、局灶階段性腎小球腎炎、多囊腎、腎小球基底膜破壞等疾病進展有一定相關性［1］。研究顯示蟲草益腎方能延緩RIF進展，前期蛋白質(zhì)組學及網(wǎng)絡藥理學研究結果提示其機制可能與影響Hippo信號通路相關［2］。通過觀察蟲草益腎方對單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠Hippo通路核心蛋白p-YAP、p-Mst1、p-Lats1及腎小管上皮細胞間充質(zhì)轉分化的標志蛋白α-SMA、E-cadherin表達的影響，從分子水平探究蟲草益腎方延緩RIF進展的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物使用許可證號：SCXK（黑）2017-014，實驗操作經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，于黑龍江中醫(yī)藥大學臨床分子生物學實驗室進行實驗。

1.2 實驗藥物 蟲草益腎方由黃芪30 g，水蛭10 g，酒蒸大黃15 g，貓須草15 g，冬蟲夏草3 g組成。黃芪、水蛭、酒蒸大黃、貓須草購自黑龍江德順長中藥飲片有限公司，冬蟲夏草粉由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腎病科提供。將黃芪、水蛭、酒蒸大黃、貓須草煎煮2次，合并濾液，加入冬蟲夏草粉攪拌均勻，再在旋轉蒸發(fā)儀中緩慢蒸發(fā)，水浴濃縮至質(zhì)量濃度為0.657 g/mL，高壓滅菌，得蟲草益腎方水煎液，密封儲存于4℃冰箱內(nèi)備用。咪達普利（達爽），天津田邊制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器 Masson三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司，YAP（D8H1X）XP Rabbit Mab 14074、Phospho-YAP（Ser109）（E519G）Rabbit Mab 53749、LATS1（C66B5） Rabbit mAB3477、Phospho-LATS1（Ser109）Antibody 9157、MST1（D8B9Q）Rabbit mAb 3477、GAPDH（D16H11）XP Rabbit mAb 5174抗體試劑盒均購于美國CST公司；AntiE-Cadherin（ab231303）購于美國艾博抗公司；Western blotting一抗稀釋液（M3001），哈爾濱新?；驒z測有限公司。旋轉蒸發(fā)器（RE-52 CS），上海亞榮生化儀器廠；生物顯微鏡（BX41），奧林巴斯（中國）有限公司；病理切片機，賽默飛世爾科技公司；數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)（SCN400），德國徠卡；超低溫冷凍存儲冰箱（DW-HL340），中科美菱低溫科技股份有限公司；轉膜電泳槽（VE 186），天能電池集團股份有限公司；高速冷凍離心機（LC-LXHRF210 E）。

1.4 模型制備［3-5］40只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組、模型組、咪達普利組、蟲草益腎方組，每組10只。適應性喂養(yǎng)1周后，禁食禁水12 h后，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉。碘伏消毒，無菌手術環(huán)境中打開腹腔，假手術組隨后即縫合腹腔，模型組、咪達普利組、蟲草益腎方組在左后腹壁找到白色細線狀輸尿管并游離，在腎盂處及輸尿管上1/3處分別用手術線結扎，兩處結扎中間位置剪斷輸尿管，少量青霉素藥粉局部給藥，最后縫合腹部皮膚，UUO模型制作完畢，單籠飼養(yǎng)24 h，正常喂養(yǎng)。

1.5 給藥方法 蟲草益腎方成人每日服藥量為73 g，根據(jù)人-鼠體表面積換算方法計算，實驗大鼠每日給藥量為6.57 g/kg。蟲草益腎方組采用蟲草益腎方水煎液灌胃，假手術組、模型組采用生理鹽水灌胃，每日劑量為10 mL/kg體質(zhì)量。咪達普利組采用咪達普利水溶液灌胃，每日劑量為0.45 mg/kg體質(zhì)量。各組均連續(xù)給藥14 d。實驗過程中觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度等一般情況。

1.6 標本采集與檢測 給藥結束后禁食12 h，禁水1 h，置于無菌條件下以10%水合氯醛0.3 mL/100 g右上腹腔注射麻醉大鼠，行腹正中線縱行切開。下腔靜脈采血后，用生理鹽水從左心房注入，直至大鼠雙腎變?yōu)樯n白色，快速剝離梗阻側腎臟。將腎臟沿腎門分成兩部分，一部分放入液氮用于Western blotting檢測，另一部分用于病理學染色。檢測項目：1）血清肌酐（Crea）、尿素氮（BUN）。全自動生化分析儀對大鼠血清Crea、BUN進行檢測。2）腎臟組織形態(tài)學檢查。腎組織用石蠟包埋后制備切片，鐵蘇木素染色后分化，沖洗。Masson返藍，沖洗。使用品紅、磷鉬酸、甲苯胺藍染色，沖洗，脫水，封片，于顯微鏡鏡下（400倍）觀察組織形態(tài)。使用Imagej軟件計算組織纖維化比例。3）腎組織YAP、p-YAP、MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、α-SMA、E-cadherin蛋白的表達。取腎臟組織冰上剪碎后、裂解，BCA法測定總蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，加入稀釋一抗的Phospho-MST1、MST1、Phos?pho-LATS1（Ser909）、LATS1、Phospho-YAP（Ser109）、YAP、GAPDH、α-SMA、E-cadherin抗體，孵育過夜，洗膜后加入二抗，孵育1 h。ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白的相對表達量，目標蛋白表達量通過GAPDH進行校正。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 假手術組大鼠體質(zhì)量較造模前增加，精神狀態(tài)好，動作敏捷，毛發(fā)光亮。模型組、咪達普利組、蟲草益腎方組大鼠體質(zhì)量減少，精神萎靡，動作遲緩，皮毛干枯，無死亡。

2.2 各組大鼠血清肌酐及尿素氮水平比較 見表1。與假手術組比較，模型組Crea、BUN明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，咪達普利組、蟲草益腎方組BUN明顯下降（P<0.05）；咪達普利組與蟲草益腎方組Crea、BUN無明顯差異。

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清肌酐、尿素氮水平比較（±s）

注：與假手術組比較，▲P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。下同。

組別假手術組模型組咪達普利組蟲草益腎方組n 10 10 10 10 Crea（μmol/L）25.07±4.51 40.55±4.62▲38.55±3.67▲38.31±2.82▲BUN（mmol/L）6.04±0.46 11.98±1.51▲8.18±0.72#▲7.97±1.02#▲

2.3 各組大鼠腎組織病理及纖維化面積的比較 見圖1，表2。Masson染色下評估腎組織RIF程度，假手術組腎間質(zhì)見極少量膠原，未見空泡。模型組腎間質(zhì)可見膠原沉積明顯增多，炎癥細胞浸潤，小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性等現(xiàn)象。咪達普利組與蟲草益腎方組局部腎間質(zhì)膠原沉積明顯少于模型組，少見空泡。與假手術組比較，模型組纖維化面積明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，咪達普利組、蟲草益腎方組纖維化面積明顯下降（P<0.05）；咪達普利組與蟲草益腎方組纖維化面積無明顯差異。

表2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積比較（%±s）

表2 各組大鼠腎間質(zhì)纖維化面積比較（%±s）

n組別假手術組模型組咪達普利組蟲草益腎方組10 10 10 10纖維化面積22.09±0.33 24.68±2.29△18.21±1.42*△17.32±1.36*△

圖1 各組大鼠腎組織病理變化（Masson染色，400倍）

2.4 各組大鼠腎臟組織MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP及α-SMA、E-cadherin蛋白表達比較 見圖2～圖3，表3～表5。與假手術組相比，模型組 p-MST1、p-LATS1、p-YAP 蛋白表達下調(diào)，MST1、LATS1、YAP蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），α-SMA蛋白表達上調(diào)，E-cadherin蛋白表達下調(diào)。與模型組相比，咪達普利組、蟲草益腎方組p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達上調(diào)，MST1、LATS1、YAP蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），α-SMA蛋白表達下調(diào)，E-cadherin蛋白表達上調(diào)。說明單側輸尿管梗阻造模能減少Hippo通路中磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白的表達，減少α-SMA蛋白的表達，增加E-cadherin蛋白的表達，蟲草益腎方和咪達普利能增加大鼠磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白的表達，增加α-SMA蛋白的表達，減少E-cadherin蛋白的表達。與咪達普利組比較，蟲草益腎方組MST1、LATS1、YAP蛋白表達無明顯差異。

圖2 各組大鼠腎組織MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP電泳條帶

圖3 各組大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin電泳條帶

表3 各組大鼠腎臟組織MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、YAP、p-YAP蛋白表達比較（±s）

組別假手術組模型組咪達普利組蟲草益腎方組n 10 10 10 10 p-MST1/GAPDH 0.97±0.17 0.18±0.04▲0.42±0.08#0.51±0.12#p-LATS1/GAPDH 0.81±0.13 0.32±0.09▲0.48±0.11#0.54±0.14#p-YAP/GAPDH 0.78±0.12 0.22±0.06▲0.39±0.11#0.43±0.13#MST1/GAPDH 1.12±0.21 1.16±0.19 1.08±0.19 1.17±0.20 LATS1/GAPDH 1.01±0.21 1.06±0.17 0.97±0.15 1.02±0.23 YAP/GAPDH 0.89±0.11 0.90±0.15 0.88±0.15 0.93±0.17

表4 各組大鼠腎組織p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白與總蛋白比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白與總蛋白比較（±s）

組別假手術組模型組咪達普利組蟲草益腎方組n 10 10 10 10 p-MST1/MST1 0.87±0.15 0.16±0.05▲0.39±0.11#0.44±0.14#p-LATS1/LATS1 0.81±0.12 0.30±0.09▲0.49±0.12#0.53±0.11#p-YAP/YAP 0.88±0.13 0.24±0.07▲0.44±0.12#0.46±0.15#

表5 各組大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠腎組織α-SMA、E-cadherin蛋白表達比較（±s）

組別假手術組模型組咪達普利組蟲草益腎方組n 10 10 10 10 α-SMA 0.19±0.05 0.93±0.15▲0.44±0.12#0.37±0.11#E-cadherin 0.89±0.16 0.21±0.03▲0.50±0.06#0.55±0.11#

3 討 論

中醫(yī)學將RIF歸屬于“虛勞”“腰痛”等疾病范疇，其發(fā)病機制主要是臟腑虛損，兼有血瘀、濁毒，應治以補益臟腑、活血化瘀、瀉濁解毒。蟲草益腎方是宋立群教授治療CKD的經(jīng)驗方，由冬蟲夏草、貓須草、黃芪、水蛭和酒蒸大黃組成，全方補益臟腑、活血化瘀、瀉濁解毒。蟲草益腎方中冬蟲夏草、黃芪為君藥，溫補諸臟腑。冬蟲夏草能調(diào)控Notch、AMPK等纖維化相關信號通路，減少細胞外基質(zhì)積聚，抑制EMT，延緩腎間質(zhì)纖維化［6-8］。黃芪通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路，以減輕細胞凋亡，并直接作用于成纖維細胞，抑制 EMT，進而減輕 RIF［9-10］。方中臣以酒蒸大黃、水蛭、貓須草活血化瘀、瀉濁解毒。大黃入血分，能活血化瘀，入氣分，則瀉濁解毒，酒蒸減輕其苦寒瀉下作用。大黃有效成分為大黃素、大黃酸等，通過抑制腎小管上皮細胞凋亡、抑制EMT，影響MAPK、HIF1α/VEGF/PDGFR-α、PI3K/Akt等信號通路，減輕RIF［11］。水蛭為蟲類藥，破血化瘀止痛，尤善走竄通絡。實驗表明［12-13］水蛭可能通過調(diào)節(jié)KIM-1、ICAM-1減輕炎癥反應，抑制TGF-β1，減輕單側輸尿管梗阻大鼠RIF程度。貓須草又名腎茶，有利水功效，現(xiàn)代藥理實驗發(fā)現(xiàn)有抗氧化應激、抑制腎小管及腎間質(zhì)成纖維細胞生長因子表達等作用，表明貓須草對慢性腎衰竭大鼠腎臟具有保護作用［1，14］。蟲草益腎方在保護慢性腎臟病患者腎臟功能，延緩RIF等方面療效確切［15］。

前期研究發(fā)現(xiàn)慢性腎衰患者服用蟲草益腎方可降低血清中Crea及BUN等毒素含量，明顯緩解乏力、食欲下降、皮膚瘙癢等癥狀［16］。研究發(fā)現(xiàn)14 d時大鼠血液中Crea及BUN含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，與前期臨床研究結果相符。染色后，鏡下觀察腎組織改變是評價腎組織結構病理改變最直觀的方法，Masson染色結果較為適合觀察腎間質(zhì)纖維化，因此選用Masson染色。與假手術組相比，模型組腎間質(zhì)可見膠原沉積明顯增多，小管上皮細胞出現(xiàn)空泡變性等現(xiàn)象，提示腎間質(zhì)纖維化模型造模成功。與模型組比較，咪達普利組與蟲草益腎方組局部腎間質(zhì)膠原沉積明顯少于模型組，少見空泡，說明咪達普利及蟲草益腎方均能減輕UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化。RIF過程中，REC被破壞，細胞經(jīng)重塑和表型改變，轉分化為成纖維細胞，參與器官纖維化過程［17］。E-cadherin是REC標志蛋白，α-SMA是肌成纖維細胞的特征蛋白［18］。Western blotting結果顯示，與假手術組相比，模型組、咪達普利組、蟲草益腎方組α-SMA蛋白表達上調(diào)、E-cadherin蛋白表達下調(diào)，提示REC轉化為成纖維細胞，RIF進行性發(fā)展。與模型組比較，咪達普利組、蟲草益腎方組α-SMA蛋白表達下調(diào)，E-cadherin蛋白表達上調(diào)，提示咪達普利、蟲草益腎方通過減少REC轉化為成纖維細胞，延緩RIF進展。

Hippo信號通路參與腎間質(zhì)纖維化進程，有研究［19］將小鼠YAP基因敲除，代表纖維化細胞分化能力的α-SMA蛋白表達相應降低，說明Hippo信號通路與纖維化密切相關。在對其他動物模型的研究中也發(fā)現(xiàn)Hippo信號通路的表達被抑制后，能明顯延緩RIF的進展［20］。Hippo信號通路是由Mst激酶、Lats激酶與YAP組成的三步激酶級聯(lián)，也是該信號通路中的核心組分，在正常情況下，活化的MST可以磷酸化并激活其底物LATS，進而直接引起下游YAP的磷酸化，p-YAP留存于細胞質(zhì)中，進一步被降解，無法進入細胞核。當Hip?po信號通路被抑制時，磷酸化YAP表達被抑制，去磷酸化的YAP表達增加并進入細胞核，在腎臟細胞核內(nèi)高表達，進一步激活下游PI3K/Akt、TGF-β/Smad等信號通路，使腎臟發(fā)生異常的增殖和修復，誘導EMT的發(fā)生，介導細胞外基質(zhì)積聚，影響RIF的進展［21-22］。本研究Western blotting結果顯示，與假手術組相比，模型組 p-MST1、p-LATS1、p-YAP 蛋白表達下調(diào)，MST1、LATS1、YAP蛋白表達基本不變，α-SMA蛋白表達上調(diào)，E-cadherin蛋白表達下調(diào)。說明在UUO制備的腎間質(zhì)纖維化模型大鼠中Hippo信號通路中MST1、LATS1與YAP組成的激酶級聯(lián)磷酸化過程受到抑制，與模型組相比，咪達普利組、蟲草益腎方組p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達上調(diào)，MST1、LATS1、YAP蛋白表達基本不變，α-SMA蛋白表達下調(diào)，E-cadherin蛋白表達上調(diào)。說明蟲草益腎方和咪達普利能上調(diào)UUO大鼠血清中磷酸化MST1、LATS1、YAP蛋白的表達水平。

本研究表明Hippo信號通路與RIF的發(fā)生發(fā)展密切相關，與既往研究相符［23］。蟲草益腎方能下調(diào)UUO大鼠梗阻側腎組織α-SMA蛋白表達水平、上調(diào)E-cad?herin蛋白表達水平，抑制EMT，延緩RIF進展，其作用機制可能與上調(diào)MST1、LATS1、YAP蛋白磷酸化水平，調(diào)節(jié)Hippo信號通路相關。后期本課題組將進一步探究Hippo信號通路在RIF進程中不同時間點的動態(tài)變化及YAP蛋白在細胞質(zhì)、細胞核中的分布情況，以明確Hippo信號通路在RIF整體進程中的作用，以及蟲草益腎方對Hippo信號通路產(chǎn)生影響的作用機制。