丁露 畢金玲 黃勇 孟曼 姚榮杰

近年來，我國肺癌發(fā)病率逐年上升，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位[1]。非小細胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer, NSCLC)患者診斷時多為晚期，喪失手術(shù)機會，5年生存率仍偏低[2]。因而尋求一種簡便微創(chuàng)的早期診斷方法是亟須解決的問題。外泌體含有特異性蛋白、細胞因子及核酸等物質(zhì)，可作為信號分子參與其他細胞的功能調(diào)節(jié)[3]，實時反應(yīng)細胞來源的生理病理變化[4]。微小RNA(microRNA, miRNA)是外泌體內(nèi)的主要核酸，當發(fā)生疾病時，外泌體內(nèi)的miRNA也相應(yīng)地發(fā)生改變，因而外泌體內(nèi)miRNA可能作為新型的分子標記物。本研究通過檢測NSCLC患者和健康受試者血清外泌體中miR-32和miR-20a表達水平，比較不同臨床病理參數(shù)之間有無差異，計算兩者和聯(lián)合的ROC曲線下面積，評價兩者診斷NSCLC的效能，探討其診斷NSCLC的臨床價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年1月至2020年9月期間就診于我院的經(jīng)細胞或組織病理學診斷為NSCLC患者共計30例，所有患者未曾接受放化療、靶向以及免疫治療，排除合并其他惡性腫瘤。年齡為49～79歲，中位年齡為67歲,所有肺癌患者按照美國癌癥聯(lián)合會(American Joint Committeeon Cancer, AJCC)的第8版TNM系統(tǒng)進行分期。同期隨機收集我院體檢健康正常者作為對照組，年齡為35～76歲，中位年齡為61歲。標本采集均經(jīng)過研究對象本人知情同意并簽字，醫(yī)院倫理委員會對本研究進行審核批準。

二、實驗與儀器

Lightcycler實時熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)，紫外分光光度計(北京凱奧公司)，低高溫超高速離心機(美國Beckman Coulter公司)，Nanosight NS300系統(tǒng)(英國NanoSight公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR擴增試劑盒(美國ABI公司)，ExoRNA提取試劑盒Trizol試劑(美國Invitrogen公司)。CD9、 HSC70、TSGl01(美國Sigma Aldrich公司)，羊抗兔二抗(北京博奧森公司)，線蟲miRNAcel-miR-39(中國Tiangen公司)。

三、研究方法

抽取所有受試者晨起空腹外周靜脈血共5mL, 用不含EDTA的采集管收集。室溫下靜置30分鐘，待全血凝固，予以室溫下離心處理。取上層血清置于-80 ℃冰箱中等待檢測，整個過程避免溶血。

1 血清外泌體的提取

從-80 ℃冰箱中取出待檢測血清樣品，在冰上進行解凍。吸取400uL血清標本，10 000×g下離心30min，取上清。予以150 000×g離心70 min，加入PBS重懸混勻，再次進行超高速離心一次，所得沉淀物即為外泌體。將沉淀物懸浮于100 μL PBS，重懸沉淀。儲存于4 ℃冰箱中待外泌體驗證。

2 血清外泌體的鑒定

外泌體表面蛋白標志物的檢測采用Western blot方法進行，抗體包括CD9、 HSP70、TSGl01。NanoSight法檢測顆粒濃度，先將樣品稀釋至5 000、10 000或20 000倍以保證樣品濃度在108～109/mL，檢測過程中Nanosight閾值設(shè)置為5，各檢測參數(shù)檢測中保持不變。

3 外泌體miRNA表達水平的測定

外泌體懸液采取 Trizol-LS 裂解，后用氯仿分離裂解相，上清液用異丙醇沉淀, 硅膠膜吸附柱純化外泌體RNA。將提取的外泌體miRNA采取加尾法進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA樣品。用SYBR GREEN法定量檢測外體miRNA-20a和miRNA-32。由于血清miRNA檢測中缺乏穩(wěn)定且公認的內(nèi)參基因，故在RNA提取過程中加入cel-miR-39作為外參基因(秀麗線蟲miR-39于Trizol裂解后迅速加入)，以規(guī)范操作技術(shù)的變異性。 應(yīng)用 △ Ct 進行數(shù)據(jù)分析 (△ Ct=miRNA的Ct值-miR-39的Ct 值)，以△Ct代表miRNA表達水平。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，應(yīng)用K-S檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，所測數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，故以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，組間比較用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)受試者工作(ROC)曲線分析ROC曲線下面積(AUC)值，計算敏感性、特異性、陽性似然比、陰性似然比和約登指數(shù)。

結(jié) 果

一、兩組臨床資料比較

收集符合納入標準的非小細胞肺癌標本共30份，同時采集健康受試者標本30份。其中肺鱗狀細胞癌12份(40.0%)，肺腺癌18份(60.0%)；Ⅰ～Ⅱ期非小細胞肺癌10份(33.3%)，Ⅲ～Ⅳ期非小細胞肺癌20份(66.7%)；中高分化19份(63.3%)，低分化11份(36.7%)。男性22例(73.3%)，女性8例(26.7%)。正常對照組男性共19例(63.3%)，女性11例(36.7%)。兩組在性別、年齡上均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

二、兩組血清外泌體miR-32和miR-20a表達水平比較

NSCLC患者血清外泌體miR-32的表達水平為1.872(0.754～27.359)，正常對照組的miR-32的表達水平為3.573(0.947～29.316)，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NSCLC患者血清外泌體miR-20a的表達水平為5.448(0.948～41.857)，而健康對照組中miR-20a的表達水平為3.318(0.642～51.326)，兩者之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 NSCLC組與正常對照組血清外泌體

P值<0.05,差異有統(tǒng)計學意義

三、血清外泌體miR-32和miR-20a表達水平與非小細胞肺癌患者臨床病理特征之間關(guān)系

分析比較NSCLC患者血清外泌體中miR-32和miR-20a的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，NSCLC血清外泌體中的miR-32和miR-20a的表達量與年齡、性別以及病理類型未見明確相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-32在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期中分別表達不同水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著腫瘤TNM分期的增加，表達呈現(xiàn)下調(diào)。另外miR-32在低分化及中高分化水平中的表達亦不同，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨著分化水平的升高，表達量出現(xiàn)升高趨。而miR-20a在不同臨床分期以及分化水平中的表達水平，均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 NSCLC患者血清外泌體miRNAs表達量與臨床病理之間關(guān)系

四、血清外泌體miR-32和miR-20a在非小細胞肺癌中的診斷效能

采用ROC評估m(xù)iR-20a在NSCLC中的診斷價值，其AUC為0.713，95%CI(0.559～0.867)，診斷臨界值為7.362時，敏感性為58.83%，特異性為84.81%。而miR-32的AUC為0.715，95%CI(0.558～0.872)，診斷臨界值為2.185時，敏感性為67.62%，特異性為81.39%。將兩者進行聯(lián)合預測NSCLC的AUC為0.825，95%CI(0.714～0.937)，其診斷敏感性為94.1%，特異性為70.6%，陽性似然比為3.2，陰性似然比為0.084，約登指數(shù)為0.647(見圖1)。

圖1 血清外泌體miR-20a和miR-32單項及聯(lián)合

討 論

miRNA是一種轉(zhuǎn)錄后在基因表達過程中起調(diào)節(jié)作用的小非編碼RNA。miRNA作為腫瘤標記物是一個新的研究領(lǐng)域，大量研究表明NSCLC的發(fā)生可能與miRNA表達失調(diào)關(guān)系密切[5-6]，miRNA有望成為NSCLC診斷潛在的分子標記物。然而由于血液中miRNA可以受到RNA酶降解以及各種因素的干擾，極其不穩(wěn)定，因此篩選全血中的miRNA作為NSCLC的腫瘤標記物可能存在一定誤差。外泌體直徑為40～100nm，大小均勻一致，具有脂質(zhì)雙分子層囊泡結(jié)構(gòu)，由多種細胞主動分泌[7]。外泌體中包涵著大量與分泌細胞相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂類及核酸等重要生物信息[8]，可以在細胞之間進行生物信息傳遞和物質(zhì)交換。外泌體由于穩(wěn)定的脂質(zhì)雙分子層，可以保護其中的miRNA免受降解，因而外泌體內(nèi)的miRNA更為穩(wěn)定，豐度更高。外泌體的來源較為廣泛，腫瘤細胞、淋巴細胞、肥大細胞等均可以分泌，但腫瘤細胞釋放的外泌體數(shù)量遠高于其他細胞[9]，因此癌癥患者的血清外泌體大多數(shù)來自腫瘤細胞，且在組成成分上面保持著腫瘤母細胞的特性[10]。因此提取NSCLC患者血清外泌體中的miRNA進行腫瘤的診斷及其判斷預后等研究具有一定的準確性及可靠性。

目前，越來越多的證據(jù)表明，血清外泌體中的miRNA可能成為NSCLC有診斷價值的腫瘤標記物。Rodríguez等[11]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC與非癌癥患者相比，NSCLC患者的血漿外泌體中可以檢測到更多具有高表達水平的miRNA。Cazzoli等[12]對肺腺癌、肺肉芽腫以及健康吸煙者的742個外泌體miRNA進行分析，篩選出4個特異性miRNA，可特異性區(qū)分肺癌患者和健康吸煙者。有報道表明[13]，miR-32在三種肺癌細胞系中的表達水平均較正常支氣管上皮細胞系減少，其在NSCLC組織中的表達與周圍鄰近的非腫瘤組織相比亦出現(xiàn)下降。也有研究證明，miR-32表達水平與NSCLC細胞增殖和轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，而miR-32的上調(diào)抑制非小細胞肺癌細胞增殖[14]。上述研究對于miR-32的檢測均基于肺癌細胞系，尚無臨床病例相關(guān)研究。本研究結(jié)果中顯示，NSCLC患者血清外泌體中miR-32的表達量與健康受試者相比出現(xiàn)下降，此外，miR-32的表達水平與肺癌的臨床分期以及分化程度密切相關(guān)，通過本研究發(fā)現(xiàn)miR-32的表達基本與以往肺癌細胞系檢測相符合，可能提示miR-32的下調(diào)在肺癌細胞的分化以及增殖調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)血清外泌體中miR-20a在NSCLC患者中的表達水平較正常人群明顯升高，且其與肺癌的臨床病理特征之間未顯示出明確的相關(guān)性，可能與臨床病例數(shù)較少有關(guān)，尚需通過擴大臨床樣本量進行驗證。miR-20a屬于miR-17-92基因簇中的一員，在大多數(shù)肺癌細胞系中高表達，通過引入外源性的miR-20a基因能夠促進肺癌細胞的生長[15]。由此可以猜測miR-20a可能系一種癌基因，參與調(diào)控腫瘤血管生成、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。王亞南[16]等對31例肺癌患者及其對應(yīng)癌旁組織中miR-20a進行檢測，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中miR-20a呈現(xiàn)高水平表達。另外有研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿中miR-20a的表達水平較良性肺疾病患者明顯升高，在肺癌患者中，miR-20a的表達與多個臨床病理特征之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性[17]，這與本研究中的血清外泌體miR-20a的分析結(jié)果基本吻合。通過本研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-32和miR-20a聯(lián)合診斷非小細胞肺癌的ROC曲線下面積為82.5%，敏感性高達94.1%，特異性為70.6%，約登指數(shù)為0.647，表明該方法聯(lián)合診斷NSCLC的可靠性較好。血清外泌體miRNA具有微創(chuàng)，簡便以及穩(wěn)定的優(yōu)勢，因而血清外泌體中的miR-32和miR-20a可能成為NSCLC潛在的臨床診斷標記物。

本研究仍存在一定局限性，如選擇的樣本量少，為了驗證本研究結(jié)果，需要在今后的研究中進一步擴大樣本量。另外對于外泌體中的miR-32和miR-20a如何作用于腫瘤細胞從而引起癌癥的機制尚需進一步研究驗證。由于目前外泌體分離技術(shù)存在一定缺陷，提取較高純度的外泌體還具有一定困難，同時外泌體中miRNA的表達受到多種因素的影響，目前還需要更高效的外泌體及miRNA的檢測技術(shù)以提高檢測的準確性。