范玉潔 俞怡雪 李玉琴 張丹丹 周衛(wèi)芳

社區(qū)獲得性肺炎是全世界，特別是發(fā)展中國家兒童住院的主要疾病之一。在5歲以上的兒童中，40%的社區(qū)獲得性肺炎患兒是由肺炎支原體(MP)感染引起的[1]。近年來，難治性肺炎支原體肺炎(RMPP)病例明顯增多[2]，早期正確識(shí)別MP感染對(duì)給予合適的治療至關(guān)重要。有研究表明，社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征毒素(CARDS TX)是MP產(chǎn)生的重要毒素，可能是決定MP毒性的關(guān)鍵因素[3]。本研究通過分析肺炎支原體肺炎(MPP)患兒肺泡灌洗液(BALF)中MP載量與臨床特征、CARDS TX表達(dá)量的關(guān)系，探索MP感染的發(fā)病機(jī)制，為MPP診療提供新的依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年1月—2019年6月在我院住院治療，確診為MPP并行支氣管鏡檢查的患兒66例(A組)，按照BALF中MP的載量不同分為兩組，高M(jìn)P(A1)組33例(MP載量>2.5×107copies/mL)，男13例(39.4%)，女20例(60.6%)，年齡(6.06±2.52)歲；低MP(A2)組33例(1.0×103copies/mL0.05)。觀察組診斷符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合兒童社區(qū)獲得性肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)符合支氣管鏡術(shù)指征[5]；(3)BALF檢出MP載量>1.0×103copies/mL；(4)入組患兒排除其他病毒、細(xì)菌感染，并除外支氣管肺發(fā)育不良、肺部包塊、遺傳代謝性疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫缺陷等病史及病史資料不完整的病例。支氣管異物對(duì)照組符合以下標(biāo)準(zhǔn)：(1)有明確的異物吸入史及刺激性嗆咳史，病程<7 d；(2)影像學(xué)檢查表現(xiàn)為明確的異物影，而未提示炎性改變；(3)2個(gè)月內(nèi)無肺部感染病史。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且征得研究對(duì)象家長的知情同意。

二、方法

1 標(biāo)本采集 (1)肺炎患兒BALF的采集：所有患兒術(shù)前禁食、禁水，取仰臥位，局麻后進(jìn)行支氣管鏡檢查及肺泡灌洗術(shù)。根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果先進(jìn)入健側(cè)，了解有無炎癥及異常，后進(jìn)入病變部位，用37 ℃生理鹽水進(jìn)行灌洗(每次注入5～10mL灌洗，總量≤5～10mL/kg)，再通過負(fù)壓將灌洗液吸出，每次灌洗液的回吸收率應(yīng)該≥40%。獲得的BALF保存于滅菌收集器送檢。(2)血標(biāo)本的采集：患兒入院后2h內(nèi)抽取外周血，后立即送檢，進(jìn)行血常規(guī)、生化全套、體液免疫、細(xì)胞免疫等檢測(cè)。

2 病原學(xué)檢測(cè)采用熒光定量PCR法檢測(cè)BALF中MP、博卡病毒(HBoV)、肺炎衣原體(CP)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)鼻病毒(HRV)、偏肺病毒(hMPV)，直接免疫熒光法檢測(cè)呼吸道常見的七種病毒：腺病毒(ADV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，腺病毒A、B型(IV-A、IV-B)、副流感病毒1～3型(PIV1～3)；在哥倫比亞選擇性培養(yǎng)基上接種BALF懸液，后置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)，具體步驟按說明書進(jìn)行操作。

3.CARDS TX的測(cè)定BALF標(biāo)本4 ℃下12000 r/min在低溫高速離心機(jī)中離心5min，管底沉淀加入0.5mL Trizol，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以pdh A為內(nèi)參[6]，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法測(cè)定CARDS TX，并用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt法比較各基因的表達(dá)差異。引物序列(見表1)。

表1 pdh A、CARDS TX引物序列

4 統(tǒng)計(jì)臨床資料 查閱入組的患兒的病史，整理出患兒一般情況、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查及免疫學(xué)檢查等結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、回顧性分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、MPP患兒臨床特征

與A2組比較，A1組患兒熱程較長，熱峰高，發(fā)生胸腔積液、肺實(shí)變、肺不張的比例高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患兒發(fā)熱、喘息、氣促、呼吸困難、鼻塞流涕、胃腸癥狀、皮疹、肝臟損害、心肌損害等表現(xiàn)的發(fā)生率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 MPP患兒臨床特征或n(%)]

二、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

1 血常規(guī)及CRP

三組間WBC計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞(NE)絕對(duì)值計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞(LYM)絕對(duì)值計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)絕對(duì)值計(jì)數(shù)、CRP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而三組間PLT計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A2組WBC計(jì)數(shù)高于A1組及B組(P<0.05)，而A1組與B組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A1組和A2組NE、CRP均高于B組，且A1組CRP高于A2組(P<0.05)，但A1組和A2組NE差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；A1組LYM、EOS低于A2組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但A2組與B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組患兒血常規(guī)及CRP比較或M(P25,P75)]

2 免疫指標(biāo)

(1)體液免疫指標(biāo)

三組間IgA、IgG、IgM平均值或中位數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

(2)細(xì)胞免疫指標(biāo)

表4 各組患兒免疫指標(biāo)比較或M(P25,P75)]

3 CARDS TX指標(biāo)

A組CARDS TX的相對(duì)表達(dá)量(5.33±3.31)高于B組(0.96±0.20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且A1組CARDS TX的相對(duì)表達(dá)量(6.41±3.26)高于A2組(4.25±3.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組患兒CARDS TX的比較

討 論

MP是介于病毒和細(xì)菌之間的一類缺乏細(xì)胞壁的小型原核病原微生物，是造成兒童社區(qū)獲得性肺炎的常見病原體。在下呼吸道感染且接受纖維支氣管鏡治療患兒中，MP檢出率最高[7]。MPP通常為自限性疾病，大部分經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療后病情可好轉(zhuǎn)，但近年來，RMPP病例也呈現(xiàn)逐年增多的趨勢(shì)。關(guān)于RMPP致病的具體機(jī)制仍不十分明確, 目前認(rèn)為主要與MP耐藥、免疫功能紊亂、混合感染、MP載量過多、黏液栓、CARDS TX等有關(guān)[8]。

MP侵入呼吸道黏膜后，借助P1蛋白等黏附蛋白黏附于上皮細(xì)胞[9]。MP接觸宿主細(xì)胞時(shí)可能促進(jìn)CARDS TX從胞質(zhì)內(nèi)向細(xì)胞膜表面的再分布，通過SP-A與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面結(jié)合，從而有助于MP向宿主細(xì)胞的黏附[6]。有研究將靈長類動(dòng)物暴露于MP、CARDS TX，兩組肺部產(chǎn)生相似的組織病理學(xué)變化[10]。我們選取確診MPP并行支氣管鏡檢查及肺泡灌洗的患兒作為研究對(duì)象，研究CARDS TX表達(dá)量與MPP的關(guān)系，結(jié)果顯示MPP患兒BALF的CARDS TX表達(dá)量明顯高于對(duì)照組患兒，且高M(jìn)P載量組患兒的CARDS TX表達(dá)量高于低MP組，說明CARDS TX與MP載量有關(guān)。

研究亦顯示，MPP患兒絕大部分伴有發(fā)熱癥狀，雖兩組患兒發(fā)熱比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但高M(jìn)PP組患兒發(fā)熱時(shí)間更長、熱峰更高，且胸腔積液、肺實(shí)變、肺不張的發(fā)生率、炎癥指標(biāo)CRP均高于低MPP組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MP感染的嚴(yán)重程度與患兒局部MP載量具有一定相關(guān)性，這一研究結(jié)果與Nilsson 等[11]的結(jié)果一致?？赡茉蚴荂ARDS TX刺激機(jī)體產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子[12]，細(xì)胞因子會(huì)促進(jìn)杯狀細(xì)胞增多，黏液分泌增加，同時(shí)CARDS TX又可致黏膜下細(xì)胞水腫、胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞脫落壞死，破壞纖毛結(jié)構(gòu)、抑制纖毛運(yùn)動(dòng)[6]，致其清除病原菌及異物的作用下降，進(jìn)而粘液栓形成，發(fā)生肺實(shí)變、肺不張，局部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)引起胸腔積液。雖然兩組均有少數(shù)患兒有合并皮疹、胃腸癥狀、肝臟損害、心肌損害等肺外并發(fā)癥的發(fā)生，但兩組間患兒肺外并發(fā)癥發(fā)生率無明顯差異，說明局部MP載量、CARDS TX表達(dá)量對(duì)其他非直接侵入器官影響較小，而主要與局部器官損害和炎癥有關(guān)。

血常規(guī)是臨床上最常用的血液檢驗(yàn)項(xiàng)目，其中WBC、CRP是判斷炎癥常用的指標(biāo)。本研究顯示高M(jìn)P組與低MP組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)較對(duì)照組均有升高，低MP組升高更明顯；兩組淋巴細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)均較對(duì)照組下降，高M(jìn)P組下降更明顯。CRP是肝臟合成的一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，感染、免疫復(fù)合物沉積、梗死等都可使血清CRP水平急劇升高，本研究病例組CRP均升高，高M(jìn)P組高于低MP組。

通過此次初步研究表明，MPP患兒BALF中CARDS TX的表達(dá)量與MP的載量有關(guān)，CARDS TX參與MPP發(fā)病，不僅能抑制呼吸道纖毛運(yùn)動(dòng)，介導(dǎo)上皮細(xì)胞的損傷甚至死亡，還能引起呼吸系統(tǒng)的免疫炎癥反應(yīng)，由此推測(cè) CARDS TX在MP感染致病過程中發(fā)揮重要作用。